А.А. Almabekova, A.K. Kusainova, O.A. Almabekov

Asfendiyarov Kazakh National medical university, Department of Chemistry Almaty Technological University Department of Chemistry, Chemical Engineering and Ecology

DEVELOPMENT OF NEW FIRE-RESISTANT COMPOSITE MATERIALS

Resume: Attention of the authors of this article attracted polyimides based on the dianhydrides of aryl-alicyclic fluorine-containing polyheterocycles. These compounds have unique properties, such as high thermal and fire resistance, chemical resistance, solubility, which along with other positive characteristics makes them indispensable in modern technology. For this purpose, composite materials based on fluorine-containing aryl-alicyclic polyimides have been developed, optimal conditions for obtaining epoxy compounds of aryl-alicyclic structure as hardeners using lignosulfonate have been found, and the physicochemical, electrical and thermal properties of synthesized polyimide have been studied.

Keywords: dianhydrides, diamines, polycondensation, epoxy compounds, polyimide, thermoplasticity, fire resistance, viscosity.

Казахский Национальный медицинский университет имени С.Д. Асфендиярова, кафедра психиатрии и наркологии, научная клинико-диагностическая лаборатория

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЦИТОКИНОВ (ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ)

В этом обзоре уделено большое внимание ключевым и актуальным в настоящее время вопросам содержания цитокинов в различных биологических жидкостях в оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток и регуляции иммунного ответа. Ключевые слова: цитокины, иммунохимия.

Цитокины.

Цитокины в настоящее время рассматривают как белковопептидные молекулы, продуцируемые различными клетками организма и осуществляющие межклеточные и межсистемные взаимодействия. Цитокины - универсальные регуляторы жизненного цикла клеток, они контролируют процессы дифференцировки, пролиферации, функциональной активации и апоптоза последних. Цитокины, продуцируемые клетками иммунной системы, называют иммуноцитокинами; они представляют собой класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, необходимых для ее развития, функционирования и взаимодействия с другими системами организма (Ковальчук Л.В. и соавт., 1999).

Являясь регуляторными молекулами, цитокины играют важную роль в осуществлении реакций врожденного и адаптивного иммунитета, обеспечивают их взаимосвязь, контролируют гемопоэз, воспаление, заживление ран, образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и многие другие жизненно важные процессы. В настоящее время существует несколько различных классификаций цитокинов, учитывающих их строение, функциональную активность,

происхождение, тип цитокиновых рецепторов. Традиционно, в соответствии с биологическими эффектами, принято выделять следующие группы цитокинов.

1) Интерлейкины (ИЛ-1 - ИЛ-18) - секреторные регуляторные белки иммунной системы, обеспечивающие медиаторное взаимодействие в

иммунной системе и связь ее с другими системами организма;

2) Интерфероны (ИФНа, ИФНр, ИФНу) -противовирусные белки с выраженным иммунорегуляторным и противоопухолевым действием;

3) Факторы некроза опухоли (ФНОа, ФНОр -лимфотоксин) - цитокины с цитотоксическим и регуляторным действием;

4) Колониестимулирующие факторы (КСФ) -стимуляторы роста и дифференцировки гемопоэтических клеток (ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ);

5) Хемокины - хемоаттрактанты для лейкоцитов;

6) Факторы роста - регуляторы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности (фактор роста фибробластов, фактор роста эндотелиальных клеток, фактор роста эпидермиса) и трансформирующий фактор роста - ТФРр. Цитокины различаются по строению, биологической активности и ряду других признаков, однако обладают общими свойствами, характерными для данного класса пептидов. Как правило, цитокины представляют собой гликозилированные полипептиды средней молекулярной массы (менее 30 kD). Цитокины вырабатываются активированными клетками в низкой концентрации непродолжительное время, при этом их синтез всегда начинается с транскрипции генов. Свое биологическое действие на клетки цитокины оказывают через рецепторы на поверхности клеток-мишеней. Связывание цитокины с соответствующим рецептором приводит к активации клеток, их пролиферации, дифференцировке или гибели.

Цитокины оказывают свое биологическое действие преимущественно локально, работая по принципу сети. Они могут действовать согласованно и вызывать каскадную реакцию, последовательно индуцируя синтез одних цитокинов другими. Такое комплексное взаимодействие цитокинов необходимо для формирования воспаления и регуляции иммунных реакций. Примером синергического взаимодействия цитокинов является стимуляция воспалительных реакций ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО, а также синтеза IgE совместным действием ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13. Антагонистическое взаимодействие цитокинов также может быть негативным регуляторным механизмом контроля развития воспалительной реакции и синтеза провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (торможение продукции ИЛ-6 в ответ на увеличение концентрации ФНО). Цитокиновая регуляция функций клеток-мишеней может осуществляться по аутокринному, паракринному или эндокринному механизму. Система цитокинов включает клетки-продуценты; растворимые цитокины и их антагонисты; клетки-мишени и их рецепторы. Клетки-продуценты:

I. Основную группу клеток-продуцентов цитокинов в иммунной системе составляют лимфоциты.

ThO вырабатывают широкий спектр цитокинов в очень низких концентрациях.

Th1 продуцируют ИЛ-2, ИФНу, ИЛ-3, ФНОа, необходимые для развития реакций клеточного иммунитета (ГЗТ, противовирусной,

противоопухолевой цитотоксичности и др.) Набор цитокинов, секретируемых Th2 (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13, ИЛ-3), определяет развитие гуморального иммунного ответа. В последние годы описана субпопуляция Th3, вырабатывающих ТФРр, который супрессирует функцию как Thl, так и Th2.

Т-цитотоксические (CD8+), В-лимфоциты, естественные киллеры являются слабыми продуцентами цитокинов.

II. Клетки макрофагально-моноцитарного ряда продуцируют цитокины, инициирующие иммунный ответ и участвующие в реакции воспаления и регенерации.

III. Клетки, не относящиеся к иммунной системе: клетки соединительной ткани, эпителия, эндотелия спонтанно, без антигенной стимуляции, секретируют цитокины, поддерживающие пролиферацию гемопоэтических клеток, и аутокринные факторы роста (ФРФ, ЭФР, ТФРР и др.) .

Иммунный статус - это комплексный показатель состояния иммунной системы, это количественная и качественная характеристика состояния

функциональной активности органов иммунной системы и некоторых неспецифических механизмов противомикробной защиты. Методы определения цитокинов. Определение содержания цитокинов в различных биологических жидкостях имеет большое значение в оценке функциональной активности

иммунокомпетентных клеток и регуляции иммунного ответа. В отдельных случаях (септический шок, бактериальный менингит), когда цитокины, в частности ФНОа, выступает в качестве ведущего фактора патогенеза, определение его содержания в крови или спинномозговой жидкости становится основным методом иммунологической диагностики.

Иногда уровень цитокинов определяют с целью дифференциальной диагностики. Например, при бактериальном менингите в спинномозговой жидкости определяется ФНОа, а при вирусных менингитах в ней обнаруживается, как правило, только ИЛ-1. Однако определение присутствия цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях может давать отрицательные результаты в связи с особенностями этих пептидов. Являясь в основном короткоживущими регуляторами, цитокины имеют небольшой полупериод жизни (до 10 мин). Некоторые цитокины содержатся в крови в крайне низких концентрациях, накапливаясь в основном в очаге воспаления, кроме того, биологическая активность цитокинов может маскироваться при связывании их с молекулами ингибиторов, циркулирующих в крови.

Существуют три различных подхода к количественному определению цитокинов: иммунохимический (ИФА), биотестирование и молекулярно-биологические тесты. Биологическое тестирование - самый

чувствительный метод, но по специфичности уступает ИФА. Различают 4 разновидности биотестирования: по цитотоксическому эффекту, по индукции пролиферации, по индукции дифференцировки и по противовирусному эффекту. По способности индуцировать пролиферацию клеток-мишеней проводят биотестирование следующих цитокинов: 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7. По цитотоксическому действию на чувствительные клетки-мишени ^929) тестируют Т№-а и TNF-p. ШИ- у тестируют по способности индуцировать экспрессию молекул ША II на клетках-мишенях. 8 тестируют по способности усиливать хемотаксис нейтрофилов. Биотесты используются больше с исследовательскими целями или для подтверждения результатов ИФА .

Более широкое распространение получило определение цитокина в сыворотке крови и других биологических материалах с помощью твердофазного ИФА. Исследование проводится в соответствии с протоколом, прилагаемом к диагностической тест-системе. Чаще всего применяют вариант сендвич-ELISA, заключающийся в следующем: один тип МКАТ к определенному цитокину иммобилизируется на внутренней поверхности ячеек планшетов для исследования. В лунки планшета вносят исследуемый материал и соответствующие стандарты и контроли. После инкубации и промывки в лунки вносят вторые МКАТ к другому эпитопу данного цитокина, конъюгированные с индикаторным ферментом (пероксидазой хрена). После инкубации и промывки в ячейки вносят субстрат-перекись водорода с хромогеном. В процессе ферментативной реакции изменяется интенсивность окраски лунок, которую измеряют на автоматическом фотометре для планшетов.

ИФА с применением МКАТ против отдельных эпитопов в молекуле цитокинов отличается высокой чувствительностью и специфичностью, кроме того, преимуществом метода является объективный автоматизированный учет результатов. Однако этот метод также не лишен недостатков, так как обнаружение присутствия молекул цитокинов еще не является показателем их биологической активности, возможность ложноположительных результатов из-

за перекрестно реагирующих антигенных эпитопов, использование ИФА не дает возможности определения цитокинов в составе иммунных комплексов.

ИФА отличается от биотестирования более низкой чувствительностью при высокой специфичности и воспроизводимости. Цитокин выявляется за счет его способности связываться с двумя разными моноклональными антителами, направленными против двух разных антигенных эпитопов в молекуле цитокина. Используется, например, комплекс стрептавидин - фермент - субстрат фермента. Однако способность большинства цитокинов образовывать комплексы с сывороточными белками и т.п. может существенно исказить результаты количественного определения уровней цитокинов. Молекулярно-биологические методы позволяют определить экспрессию цитокиновых генов в исследуемом материале, т.е. присутствие соответствующей мРНК. Наиболее чувствительной считается обратная транскриптаза полимеразная цепная реакция (RT-PCR). Обратная транскриптаза (ревертаза) используется для получения сДНК копий с мРНК, выделенной из клеток. Количество сДНК отражает исходное количество мРНК и косвенно отражает активность продукции данного цитокина.Изучение продукции цитокинов в культурах цельной крови или выделенных из крови мононуклеаров позволяет охарактеризовать секреторную активность моноцитов крови,

индуцированную митогенами: Кон А, ФГА, ЛПС. Интерпретация данных в динамике позволяет прогнозировать дальнейшее течение при органоспецифических аутоиммунных заболеваниях, при рассеянном склерозе, при оценке эффективности применяемых методов иммунотерапии опухолей и т.д.

Тестирование по биологическим эффектам, как правило, недостаточно чувствительно и иногда недостаточно информативно. Присутствие в той же биологической жидкости молекул ингибиторов или антагонистов может маскировать биологическую активность цитокинов. При этом нередко разные цитокины проявляют одинаковую биологическую активность. Кроме того, постановка биологических тестов требует специального дополнительного оснащения, проводится в нестандартных условиях и используется преимущественно в научно-исследовательских целях. Заключение.

Таким образом, в настоящее время не вызывает сомнения, что цитокины являются важнейшими факторами иммунопатогенеза. Изучение уровня цитокинов позволяет получить информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток, соотношении процессов активации Т-хелперов I и II типов, что очень важно при дифференциальной диагностике ряда инфекционных и иммунопатологических процессов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Гумилевская О.П., Гумилевский Б.Ю., Антонов Ю.В. Способность лимфоцитов периферической крови больных поллинозом секретировать IL-4, INF при поликлональной стимуляции in vitro // Цитокины и воспаление. Материалы международной научно- практической школы - конференции. - СПб.: 2002. - Т. 1. - С. 94-98.

2 Булина О.В., Калинина Н.М. Анализ параметров цитокинового звена иммунитета у детей, страдающих атопическим дерматитом // Цитокины и воспаление. - 2002. - № 2. - С. 92-97.

3 Скляр Л.Ф., Маркелова Е.В. Цитокинотерапия рекомбинантным интерлейкином-2 (ронколейкином) у больных с вирусным гепатитом // Цитокины и воспаление. - 2002. - № 4. - С. 43-66.

4 Marty C., Misset B, Tamion F, et al. Circulating interleukin-8 concentrations in patients with multiple organ failure of septic and nonseptic origin // Critical Care Medicine. - 1994. - V. 22. - P. 673-679.

5 Шаимова В.А., Симбирцев, АЮ.Котов. Провоспалительные цитокины при различных типах течения гнойной язвы роговицы // Цитокины и воспаление. Материалы международной научно - практической школы. - СПб.: 2002. - № 2. - С. 52-58.

6 Teitelbaum S.L. Bone resorption by osteoclasts // Science. - 2000. - V. 289. - P. 1504-1508.

7 Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. - М.: 2002. - 736 с.

8 У.Пол Иммунология. - М.: Мир,1987. - 274 с.

9 Г.Фримел Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.

10 А.В.Караулов Клиническая иммунология. - М.: Медицинское информационное агентство, 1999 - 604 с.

11 Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунная недостаточность. - М.: Медицинская книга, 2003 - 240 с.

12 Дж. Клаус Лимфоциты. Методы. - М.: Мир, 1990. - 214 с.

13 Меньшиков И.В., Берулова Л.В. Основы иммунологии. Лабораторный практикум. - Ижевск: 2001. - 134 с.

14 Петров Р.В. Иммунология. - М.: Медицина, 1987. - 329 с.

15 Ройт А. Основы иммунологии. - М.: Мир, 1991. - 327 с.

16 Тотолян А.А., Фрейдлин И.С.// Клетки иммунной системы. 1,2 том. -Санкт-Петербург, Наука, - 2000 - 321с.

17 Стефании Д.В., Вельтищев Ю.Е. Клиническая иммунология детского возраста. - М.: Медицина, 1996. - 383 с.

18 Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. - СПб.: Наука, 2001. - 391 с.

19 Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорова И.Г. Иммунология. - М.: Медицина, 2000. - 430 с.

20 Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М.: ВНИРО, 1995. - 219 с.

21 Беляева О. В., Кеворков Н. Н. Влияние комплексной терапии на показатели местного иммунитета больных пародонтитом // Цитокины и воспаление. - 2002. - Т. 1. - № 4. - С. 34-37.

22 Y.T. Chang Cytokine gene polymorphisms in Chinese patients with psoriasis // British Journal of Dermatology. - 2007. -Vol. 156. - P. 899-905.

23 W. Baran IL-6 and IL-10 promoteir gene polymorphiisms in psoriasis vulgaris // Acta Derm Venereol. - 2008. - Vol. 88. -P. 113-116.

24 L. Borska Immunologic changes in TNF-alpha, sE-selectin, sP-selectin, sICAM-1, and IL-8 in pediatric patients treated for psoriasis with the goeckerman regimen // Pediatric Dermatology. - 2007. - Vol. 24. - № 6. - P. 607-612.

25 M. O"Kane Increased expression of the orphan nuclear receptor NURR1 in psoriasis and modulation following TNF-a inhibition // Journal of Investigative Dermatology. - 2008. - Vol. 128. - P. 300-310.

26 G. Fiorino Review article: anti TNF-a induced psoriasis in patients with inflammatory bowel disease // Aliment Pharmacol Ther. - 2009. - Vol. 29. - P. 921-927.

27 A.M. Tobin, B. Kirby TNFa inhibitors in the treatment of psoriasis and psoriatic arthritis // Biodrugs. - 2005. - Vol. 19. - № 1. - P. 47-57.

28 A.B. Serwin Tumour necrosis factor alpha (TNF-a) converting enzyme and soluble TNF-a receptor type 1 in psoriasis patients in relation to the chronic alcohol consumption // Journal European Academy of Dermatology and Venereology. -2008. - Vol. 22. - P. 712-717.

29 O. Arican Serum levels of TNF-a, IFN-y, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, and IL-18 in patients with active psoriasis and correlation with disease severity // Mediators of Inflammation. - 2005. - Vol. 5. - P. 273-279.

30 A. Mastroianni Cytokine profiles during infliximab monotherapy in psoriatic arthritis // British Journal of Dermatology. -2005. - Vol. 153. - P. 531-536.

А.Ш. Орадова, К.З. Садуакасова, С.Д. Лесова

С.Ж. Асфендияров атындагы К,азац ¥лттыц медицина университету Наркология жэне психиатрия кафедрасы, гылыми клиникалыц-диагностикалыц зертхана

ЦИТОКИННЫН, ЗЕРТХАНАЛЬЩ ДИАГНОСТИКАСЫ

Тушн: Шолуы бул улкен назар ман,ызды белшген жэне сура; кекейкесп K;a3ipri уа;ытта эр TYрлi биологиялы; суйьщтык;тарда иммун кузырлы жасушаларды функционалды; белсендшкт багалауда цитокиндердщ мазмунию жэне иммундi жауаптын, реттеук

ТYЙiндi сездер: цитокин, иммунитетке;атысты химия.

A.Sh. Oradova, K.Z. Saduakasova, S.D. Lesova

Asfendiyarov Kazakh National medical university, Department of Psychiatry and Narcology, Scientific Clinical and Diagnostic Laboratory

LABORATORY DIAGNOSIS OF CYTOKINES

Resume: In this review, paid great attention to critical and emerging issues currently cytokine content in various biological fluids in the assessment of the functional activity of immune cells and the regulation of the immune response. Keywords: cytokines, immunochemistry.

УДК 616.831-005.1-056:616.12-008.331.1

А.Ш. Орадова, А.Д. Сапаргалиева, Б.К. Дюсембаев

Казахский Национальный медицинский университет имени С.Д. Асфендиярова, кафедра патологической анатомии

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ РАЗВИТИЯ ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

В последнее время значительное количество исследований посвящено поиску наследственных факторов, предрасполагающих к развитию сосудистых заболеваний мозга. Одно из главных направлений в этих исследованиях -изучение роли генов-кандидатов. В настоящем обзоре нами систематизированы результаты молекулярно-генетических исследований последних лет по изучению связи различных классов «кандидатных генов» с риском развития ишемических инсультов у человека. Ключевые слова: ишемический инсульт, гены-кандидаты.

В настоящее время достаточно хорошо изучена роль таких факторов риска развития ишемического инсульта, как артериальная гипертензия, атеросклероз, нарушение ритма сердца, инфаркт, курение, сахарный диабет, нарушение липидного обмена, изменения в системе гемостаза, применение оральных контрацептивов, злоупотребление

алкоголем и др. . Известно, что тяжесть ишемического инсульта возрастает при сочетании нескольких факторов риска, среди которых значительными являются артериальная гипертензия, гиперхолестеринемия, увеличение уровня липопротеинов низкой плотности, курение. Внедрение в клиническую практику рациональной

В настоящей главе будет рассмотрен комплексный подход в оценке системы цитокинов с использованием описанных ранее современных методов исследования.

Вначале мы изложим основные представления о системе цитокинов.

Цитокины в настоящее время рассматривают как белковопептидные молекулы, продуцируемые различными клетками организма и осуществляющие межклеточные и межсистемные взаимодействия. Цитокины - универсальные регуляторы жизненного цикла клеток, они контролируют процессы дифференцировки, пролиферации, функциональной активации и апоптоза последних.

Цитокины, продуцируемые клетками иммунной системы, называют иммуноцитокинами; они представляют собой класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, необходимых для ее развития, функционирования и взаимодействия с другими системами организма (Ковальчук Л.В. и соавт., 1999).

Являясь регуляторными молекулами, цитокины играют важную роль в осуществлении реакций врожденного и адаптивного иммунитета, обеспечивают их взаимосвязь, контролируют гемопоэз, воспаление, заживление ран, образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и многие другие жизненно важные процессы.

В настоящее время существует несколько различных классификаций цитокинов, учитывающих их строение, функциональную активность, происхождение, тип цитокиновых рецепторов. Традиционно, в соответствии с биологическими эффектами, принято выделять следующие группы цитокинов.

1. Интерлейкины (ИЛ-1-ИЛ-33) - секреторные регуляторные белки иммунной системы, обеспечивающие медиаторные взаимодействия в иммунной системе и связь ее с другими системами организма. Интерлейкины разделяют по функциональной активности на про- и противовоспалительные цитокины, ростовые факторы лимфоцитов, регуляторные цитокины и др.

3. Факторы некроза опухоли (ФНО) - цитокины с цитотоксическим и регуляторным действиями: ФНОа и лимфотоксины (ЛТ).

4. Факторы роста гемопоэтических клеток - фактор роста стволовых клеток (Kit - ligand), ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-11, эритропоэтин, тробопоэтин, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор - ГМ-КСФ, гранулоцитарный КСФ - Г-КСФ, макрофагаль-

ный КСФ - М-КСФ).

5. Хемокины - С, СС, СХС (ИЛ-8), СХ3С - регуляторы хемотаксиса различных типов клеток.

6. Факторы роста нелимфоидных клеток - регуляторы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности (фактор роста фибробластов - ФРФ, фактор роста эндотелиальных клеток, эпидермальный фактор роста - ЭФР эпидермиса) и трансформирующие факторы роста (ТФРβ, ТФРα).

Среди прочих в последние годы активно изучается фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (миграцию ингибирующий фактор - МИФ), который рассматривается как нейрогормон с цитокиновой и ферментной активностью (Суслов А.П., 2003; Ковальчук Л.В. и соавт.,

Цитокины различаются по строению, биологической активности и другим свойствам. Однако наряду с различиями цитокины обладают общими свойствами, характерными для данного класса биорегуляторных молекул.

1. Цитокины - это, как правило, гликозилированные полипептиды средней молекулярной массы (менее 30 кD).

2. Цитокины вырабатываются клетками иммунной системы и другими клетками (например, эндотелием, фибробластами и др.) в ответ на активирующий стимул (патогенассоциированные молекулярные структуры, антигены, цитокины и др.) и участвуют в реакциях врожденного и адаптивного иммунитета, регулируя их силу и продолжительность. Некоторые цитокины синтезируются конститутивно.

3. Секреция цитокинов - короткий по времени процесс. Цитокины не сохраняются как преформированные молекулы, а их

синтез начинается всегда с транскрипции генов. Клетки вырабатывают цитокины в низкой концентрации (пикограммы на миллилитр).

4. В большинстве случаев цитокины продуцируются и действуют на клетки-мишени, находящиеся в непосредственной близости (короткодистантное действие). Основное место действия цитокинов - межклеточный синапс.

5. Избыточность системы цитокинов проявляется в том, что каждый тип клеток способен продуцировать несколько цитокинов, а каждый цитокин может секретироваться различными клетками.

6. Для всех цитокинов характерна плейотропность, или полифункциональность действия. Так, проявление признаков воспаления обусловлено влиянием ИЛ-1, ФНОα, ИЛ-6, ИЛ-8. Дублирование функций обеспечивает надежность работы системы цитокинов.

7. Действие цитокинов на клетки-мишени опосредуется высокоспецифичными высокоаффинными мембранными рецепторами, представляющими собой трансмембранные гликопротеины, состоящие, как правило, более чем из одной субъединицы. Внеклеточная часть рецепторов ответственна за связывание цитокина. Существуют рецепторы, устраняющие избыток цитокинов в патологическом очаге. Это так называемые рецепторы-ловушки. Растворимые рецепторы представляют собой внеклеточный домен мембранного рецептора, отделенный с помощью фермента. Растворимые рецепторы способны нейтрализовывать цитокины, участвовать в транспорте их в очаг воспаления и в выведении из организма.

8. Цитокины работают по принципу сети. Они могут действовать согласованно. Многие функции, приписываемые первоначально одному цитокину, как оказалось, обусловлены согласованным действием нескольких цитокинов (синергизм действия). Примерами синергического взаимодействия цитокинов являются стимуляция воспалительных реакций (ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОа), а также синтеза IgE

(ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13).

Одни цитокины индуцируют синтез других цитокинов (каскад). Каскадность действия цитокинов необходима для развития воспалительных и иммунных реакций. Способность одних цитокинов усиливать или ослаблять продукцию других обусловливает важные позитивные и негативные регуляторные механизмы.

Известно антагонистическое действие цитокинов, например продукция ИЛ-6 в ответ на увеличение концентрации ФНОа может быть

негативным регуляторным механизмом контроля выработки этого медиатора при воспалении.

Цитокиновая регуляция функций клеток-мишеней осуществляется с помощью аутокринного, паракринного или эндокринного механизмов. Некоторые цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОα и др.) способны участвовать в реализации всех перечисленных механизмов.

Ответ клетки на влияние цитокина зависит от нескольких факторов:

От типа клеток и их исходной функциональной активности;

От локальной концентрации цитокина;

От присутствия других медиаторных молекул.

Таким образом, клетки-продуценты, цитокины и специфические для них рецепторы на клетках мишенях формируют единую медиаторную сеть. Именно набор регуляторных пептидов, а не индивидуальные цитокины, определяют окончательный ответ клетки. В настоящее время система цитокинов рассматривается как универсальная система регуляции на уровне целостного организма, обеспечивающая развитие защитных реакций (например, при инфекции).

В последние годы сложилось представление о системе цитокинов, объединяющей:

1) клетки-продуценты;

2) растворимые цитокины и их антагонисты;

3) клетки-мишени и их рецепторы (рис. 7.1).

Нарушения различных компонентов системы цитокинов приводят к развитию многочисленных патологических процессов, а потому выявление дефектов в этой регуляторной системе имеет важное значение для правильной постановки диагноза и назначения адекватной терапии.

Вначале рассмотрим основные компоненты системы цитокинов.

Клетки-продуценты цитокинов

I. Основную группу клеток-продуцентов цитокинов в адаптивном иммунном ответе представляют лимфоциты. Покоящиеся клетки не секретируют цитокины. При распознавании антигена и при участии рецепторных взаимодействий (CD28-CD80/86 для Т-лимфоцитов и СD40-CD40L для В-лимфоцитов) происходит активация клеток, приводящая к транскрипции генов цитокинов, трансляции и секреции гликозилированных пептидов в межклеточное пространство.

Рис. 7.1. Система цитокинов

CD4 Т-хелперы представлены субпопуляциями: Тh0, Тh1, Тh2, Тh17, Tfh, которые различаются между собой спектром секретируемых цитокинов в ответ на различные антигены.

Тh0 вырабатывают широкий спектр цитокинов в очень низких концентрациях.

Направление дифференцировки Th0 определяет развитие двух форм иммунного ответа с преобладанием гуморальных или клеточных механизмов.

Природа антигена, его концентрация, локализация в клетке, тип антигенпрезентирующих клеток и определенный набор цитокинов регулируют направление дифференцировки Тh0.

Дендритные клетки после захвата и процессинга антигена представляют антигенные пептиды Th0 клеткам и вырабатывают цитокины, регулирующие направление их дифференцировки в эффекторные клетки. Роль индивидуальных цитокинов в данном процессе отражена на рис. 7.2. ИЛ-12 индуцирует синтез ИФНγ Т-лимфоцитами и ]ЧГК. ИФНу обеспечивает дифференцировку ТЫ1, которые начинают секретировать цитокины (ИЛ-2, ИФНу, ИЛ-3, ФНОа, лимфотоксины), регулирующие развитие реакций на внутриклеточные патогены

(гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и различные типы клеточной цитотоксичности).

ИЛ-4 обеспечивает дифференцировку Тh0 в Тh2. Активированные Тh2 вырабатывают цитокины (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-13 и др.), определяющие пролиферацию В-лимфоцитов, их дальнейшую дифференцировку в плазматические клетки,и развитие реакций антителогенеза, преимущественно на внеклеточные патогены.

ИФНу негативно регулирует функцию Тh2-клеток и, наоборот, ИЛ-4, ИЛ-10, секретируемые Тh2, угнетают функцию Тh1 (рис. 7.3). Молекулярный механизм этой регуляции связан с транскрипционными факторами. Экспрессия Т-bet и STAT4, детерминированная ИФНу, направляет дифференцировку Т-клеток по пути Тh1 и супрессирует развитие Тh2. ИЛ-4 индуцирует экспрессию GATA-3 и STAT6, что соответственно обеспечивает превращение наивных ТЫ0 в Тh2-клетки (рис. 7.2).

В последние годы описана особая субпопуляция Т-клеток хелперов (Тh17), продуцирующих ИЛ-17. Члены семейства ИЛ-17 могут экспрессироваться активированными клетками памяти (CD4CD45RO), у5Т-клетками, NKT клетками, нейтрофилами, моноцитами под влиянием ИЛ-23, ИЛ-6, ТФРβ, вырабатываемых макрофагами и дендритными клетками. Основным дифференцировочным фактором у человека является ROR-C, у мышей - ROR-γl Показана кардинальная роль ИЛ-17 в развитии хронического воспаления и аутоиммунной патологии (см. рис. 7.2).

Кроме того, Т-лимфоциты в тимусе могут дифференцироваться в естественные клетки-регуляторы (Treg), экспрессирующие поверхностные маркеры CD4 + CD25 + и транскрипционный фактор FOXP3. Эти клетки способны подавлять иммунный ответ, опосредуемый Тh1 и Тh2-клетками, путем прямого межклеточного контакта и синтеза ТФРβ и ИЛ-10.

Схемы дифференцировки клонов Тh0 и секретируемых ими цитокинов представлены на рис. 7.2 и 7.3 (см. также цв. вклейку).

Т-цитотоксические клетки (CD8 +), естественные киллеры - слабые продуценты цитокинов, таких, как интерфероны, ФНОа и лимфотоксины.

Избыточная активация одной из субпопуляций Тh может определить развитие одного из вариантов иммунного ответа. Хроническая несбалансированность активации Тh способна привести к формированию иммунопатологических состояний, связанных с проявления-

ми аллергии, аутоиммунной патологии, хронических воспалительных процессов и др.

Рис. 7.2. Различные субпопуляции Т-лимфоцитов, продуцирующие цитокины

II. В системе врожденного иммунитета основными продуцентами цитокинов являются клетки миелоидного ряда. С помощью Toll-по- добных рецепторов (TLRs) они распознают сходные молекулярные структуры различных патогенов, так называемые патогенассоциированные молекулярные патерны (РАМП), например липополисахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий, липотейхоевые кислоты, пептидогликаны грамположительных микроорганизмов, флагеллин, ДНК, богатую неметилированными СрG повторами, и др. В результате

такого взаимодействия с TLR запускается внутриклеточный каскад передачи сигнала, приводящий к экспрессии генов двух основных групп цитокинов: провоспалительных и ИФН типа 1 (рис. 7.4, см. также цв. вклейку). Главным образом эти цитокины (ИЛ-1, -6, -8, -12, ФНОа, ГМ-КСФ, ИФН, хемокины и др.) индуцируют развитие воспаления и участвуют в защите организма от бактериальных и вирусных инфекций.

Рис. 7.3. Спектр цитокинов, секретируемых ТЫ1- и ТЫ2-клетками

III. Клетки, не относящиеся к иммунной системе (клетки соединительной ткани, эпителия, эндотелия), конститутивно секретируют аутокринные факторы роста (ФРФ, ЕФР, ТФРр и др.). и цитокины, поддерживающие пролиферацию гемопоэтических клеток.

Цитокины и их антагонисты подробно описаны в ряде монографий (Ковальчук Л.В. и соавт., 2000; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С.,

Рис. 7.4. TLR-опосредованная индукция выработки цитокинов клетками врожденного иммунитета

Избыточная экспрессия цитокинов небезопасна для организма и может привести к развитию чрезмерной воспалительной реакции, острофазового ответа. В регуляции выработки провоспалительных цитокинов принимают участие различные ингибиторы. Так, описан ряд веществ, которые неспецифически связывают цитокин ИЛ-1 и препятствуют проявлению его биологического действия (а2-макроглобулин, С3-компонент комплемента, уромодулин). Специфическими ингибиторами ИЛ-1 могут быть растворимые рецепторы-ловушки, антитела и рецепторный антагонист ИЛ-1 (ИЛ-1RA). При развитии воспаления происходит усиление экспрессии гена ИЛ-1RA. Но и в норме этот антагонист присутствует в крови в высокой концентрации (до 1 нг/мл и более), блокируя действие эндогенного ИЛ-1.

Клетки-мишени

Действие цитокинов на клетки-мишени опосредуются через специфические рецепторы, связывающие цитокины с очень высокой аффинностью, причем отдельные цитокины могут использовать

общие субъединицы рецепторов. Каждый цитокин связывается со своим специфическим рецептором.

Рецепторы цитокинов представляют собой трансмембранные белки и делятся на 5 основных типов. Наиболее распространен так называемый гемопоэтиновый тип рецепторов, имеющих два экстраклеточных домена, один из которых содержит общую последовательность аминокислотных остатков двух повторов триптофана и серина, разделенных любой аминокислотой (WSXWS-мотив). Второй тип рецепторов может иметь два внеклеточных домена с большим количеством консервативных цистеинов. Это рецепторы семейства ИЛ-10 и ИФН. Tретий тип представлен рецепторами цитокинов, относящихся к группе ФНО. Четвертый тип рецепторов цитокинов принадлежит к суперсемейству иммуноглобулиновых рецепторов, имеющих внеклеточные домены, напоминающие по строению домены молекул иммуноглобулинов. Пятый тип рецепторов, связывающих молекулы семейства хемокинов, представлен трансмембранными белками, пересекающими клеточную мембрану в 7 местах. Рецепторы цитокинов могут существовать в растворимой форме, сохраняя способность связывать лиганды (Кетлинский С.А. и др., 2008).

Цитокины способны влиять на пролиферацию, дифференцировку, функциональную активность и апоптоз клеток-мишеней (см. рис. 7.1). Проявление биологической активности цитокинов в клетках-мишенях зависит от участия различных внутриклеточных систем в передаче сигнала от рецептора, что связано с особенностями клеток-мишеней. Сигнал к апоптозу проводится в том числе с помощью специфического участка семейства рецепторов ФНО, так называемого домена «смерти» (рис. 7.5, см. цв. вклейку). Дифференцировочный и активирующий сигналы передаются посредством внутриклеточных белков Jak-STAT - сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции (рис. 7.6, см. цв. вклейку). G-белки участвуют в передаче сигнала от хемокинов, что приводит к усилению миграции и адгезии клеток.

В комплексный анализ системы цитокинов входит следующее.

I. Оценка клеток-продуцентов.

1. Определение экспрессии:

Рецепторов, распознающих патоген или антиген TКР, TLR) на уровне генов и молекулы белка (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии);

Адаптерных молекул, проводящих сигнал, запускающий транскрипцию цитокиновых генов (ПЦР и др.);

Рис. 7.5. Передача сигнала с ФНО-рецептора

Рис. 7.6. Jak-STAT - сигнальный путь с цитокиновых рецепторов типа 1

Генов цитокинов (ПЦР); белковых молекул цитокинов (оценка цитокинсинтезирующей функции мононуклеарных клеток человека).

2. Количественное определение субпопуляций клеток, содержащих те или иные цитокины: Th1, Th2 Th17 (метод внутриклеточного окрашивания цитокинов); определение количества клеток, секретирующих определенные цитокины (метод ELISPOT, см. гл. 4).

II. Оценка цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма.

1. Tестирование биологической активности цитокинов.

2. Количественное определение цитокинов с помощью ИФА.

3. Иммуногистохимическое окрашивание цитокинов в тканях.

4. Определение соотношения оппозитных цитокинов (про- и противовоспалительных), цитокинов и антагонистов рецепторов цитокинов.

III. Оценка клеток-мишеней.

1. Определение экспрессии рецепторов цитокинов на уровне генов и белковой молекулы (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии).

2. Определение сигнальных молекул во внутриклеточном содержимом.

3. Определение функциональной активности клеток-мишеней.

В настоящее время разработаны многочисленные методы оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию. Среди них различают:

1) молекулярно-биологические методы;

2) методы количественного определения цитокинов с помощью иммуноанализа;

3) тестирование биологической активности цитокинов;

4) внутриклеточное окрашивание цитокинов;

5) метод ELISPOT, позволяющий выявить цитокины вокруг единичной цитокинпродуцирующей клетки;

6) иммунофлюоресценцию.

Приводим краткую характеристику этих методов.

С помощью молекулярно-биологических методов можно исследовать экспрессию генов цитокинов, их рецепторов, сигнальных молекул, изучать полиморфизм указанных генов. В последние годы выполнено большое число работ, выявивших ассоциации между вариантами аллелей генов молекул системы цитокинов и предрасположенностью

к ряду заболеваний. Изучение аллельных вариантов генов цитокинов может дать информацию о генетически запрограммированной продукции того или иного цитокина. Наиболее чувствительной считается полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР-РВ (см. гл. 6). Метод гибридизации in situ позволяет уточнить тканевую и клеточную локализацию экспрессиии цитокиновых генов.

Количественное определение цитокинов в биологических жидкостях и в культурах мононуклеарных клеток периферической крови методом ИФА можно охарактеризовать следующим образом. Поскольку цитокины являются локальными медиаторами, более целесообразно измерять их уровни в соответствующих тканях после экстракции тканевых протеинов или в естественных жидкостях, например в слезе, смывах из полостей, моче, амниотической жидкости, спинномозговой жидкости и т.д. Уровни цитокинов в сыворотке или других биологических жидкостях отражают текущее состояние иммунной системы, т.е. синтез цитокинов клетками организма in vivo.

Определение уровней продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови (МНК) показывает функциональное состояние клеток. Спонтанная продукция цитокинов МНК в культуре свидетельствует, что клетки уже активированы in vivo. Индуцированный (различными стимуляторами, митогенами) синтез цитокинов отражает потенциальную, резервную способность клеток отвечать на антигенный стимул (в частности, на действие лекарственных препаратов). Сниженная индуцированная продукция цитокинов может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Цитокины не специфичны в отношении конкретного антигена. Поэтому специфическая диагностика инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний с помощью определения уровня тех или иных цитокинов невозможна. В то же время оценка уровней цитокинов позволяет получить данные о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и прогнозе, функциональной активности клеток иммунной системы, о соотношении Th1- и Th2-клеток, что очень важно при дифференциальной диагностике ряда инфекционных и иммунопатологических процессов.

В биологических средах можно определить цитокины количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа, используя поликлональные и моноклональные антитела (см. гл. 4). ИФА позволяет узнать, каковы точные концентрации цитокинов в био-

логических жидкостях организма. Иммуноферментное выявление цитокинов имеет ряд преимуществ перед другими методами (высокая чувствительность, специфичность, независимость от присутствия антагонистов, возможность точного автоматизированного учета, стандартизации учета). Однако и этот метод имеет свои ограничения: ИФА не характеризует биологическую активность цитокинов, может давать ложные результаты за счет перекрестно-реагирующих эпитопов.

Биологическое тестирование проводят на основе знания основных свойств цитокинов, их действия на клетки-мишени. Изучение биологических эффектов цитокинов позволило разработать четыре разновидности тестирования цитокинов:

1) по индукции пролиферации клеток-мишеней;

2) по цитотоксическому эффекту;

3) по индукции дифференцировки костно-мозговых предшественников;

4) по противовирусному действию.

ИЛ-1 определяют по стимулирующему действию на пролиферацию мышиных тимоцитов, активированных митогеном in vitro; ИЛ-2 - по способности стимулировать пролиферативную активность лимфобластов; по цитотоксическому действию на мышиные фибробласты (L929) тестируют ФНОа и лимфотоксины. Колониестимулирующие факторы оценивают по их способности поддерживать рост костномозговых предшественников в виде колоний в агаре. Противовирусную активность ИФН выявляют по угнетению цитопатического действия вирусов в культуре диплоидных фибробластов человека и опухолевой линии фибробластов мышей L-929.

Созданы клеточные линии, рост которых зависит от присутствия определенных цитокинов. В табл. 7.1 представлен список клеточных линий, используемых для тестирования цитокинов. По способности индуцировать пролиферацию чувствительных клеток-мишеней проводят биотестирование ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-15 и др. Однако эти методы тестирования отличаются недостаточной чувствительностью и информативностью. Молекулы ингибиторов и антагонистов могут маскировать биологическую активность цитокинов. Некоторые цитокины проявляют общую биологическую активность. Тем не менее эти методы идеальны для тестирования специфической активности рекомбинантных цитокинов.

Таблица 7.1. Клеточные линии, используемые для тестирования биологической активности цитокинов

Окончание табл. 7.1

Лабораторная работа 7-1

Определение биологической активности ИЛ-1 по комитогенному действию на пролиферацию тимоцитов мышей

В основе метода биологического тестирования ИЛ-1 лежит способность цитокина стимулировать пролиферацию мышиных тимоцитов.

ИЛ-1 может быть определен в культуре моноцитов, стимулированных ЛПС, а также в любой биологической жидкости организма. Необходимо обратить внимание на ряд деталей.

1. Для тестирования применяют тимоциты мышей линии С3Н/ HeJ, стимулированные к пролиферации митогенами (конканавалин А - КонА и фитогемагглютинин - ФГА). Тимоциты С3Н/HeJ выбраны не случайно: мыши этой инбредной линии не отвечают на ЛПС, который может находиться в составе тестируемого материала и вызывать продукцию ИЛ-1.

2. Тимоциты отвечают на ИЛ-2 и митогены, поэтому в препаратах, тестируемых на ИЛ-1, следует определять также присутствие ИЛ-2 и митогенов.

Порядок работы

1. Получают суспензию тимоцитов в концентрации 12×10 6 /мл среды RРМI 1640, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров и 2-меркаптоэтанол (5×10 -5 М).

2. Готовят ряд последовательных двукратных разведений опытных (биологические жидкости организма) и контрольных образцов. В качестве контрольных используют биологические жидкости, содержащие ИЛ-1 или образцы, полученные при инкубации мононуклеарных клеток без ЛПС, и лабораторный стандартный ИЛ-1-содержащий препарат. В 96-луночные круглодонные планшеты из каждого разведения переносят по 50 мкл в 6 лунок.

3. В три лунки каждого разведения добавляют по 50 мкл растворенного в полной среде очищенного ФГА (Wellcome) в концентрации 3 мкг/мл, а в другие 3 лунки - по 50 мкл среды.

4. В каждую лунку добавляют по 50 мкл суспензии тимоцитов и инкубируют в течение 48 ч при 37 °С.

6. Перед завершением культивирования в лунки вносят по 50 мкл раствора (1 мкКи/мл) [" 3 Н]-тимидина и инкубируют еще 20 ч.

7. Для определения уровня радиоактивности клетки культуры переносят на фильтровальную бумагу с помощью автоматического сборщика клеток, фильтры высушивают и определяют включение метки жидкостным сцинтилляционным счетчиком.

8. Результаты выражают в виде коэффициента стимуляции.

где m cp - среднее число импульсов в 3 лунках.

Если тимоциты отвечают на стимуляцию стандартным ИЛ-1, то индекс стимуляции исследуемого образца, превышающий 3, достоверно свидетельствует об ИЛ-1-активности.

Биоанализ является единственным методом для оценки функционирования цитокина, но данный метод должен быть дополнен разными видами соответствующего контроля на специфичность с использованием моноклональных антител. Добавление определенных моноклональных антител к цитокину в культуру блокирует биологическую активность цитокина, что доказывает: сигналом к пролиферации клеточной линии служит определяемый цитокин.

Использование биоанализа для выявления интерферона. Принцип оценки биологической активности ИФН основан на его противовирусном действии, которое определяется по степени ингибиции размножения тест-вируса в культуре клеток.

В работе могут быть использованы клетки, чувствительные к действию ИФН: первично трипсинизированные клетки-фибробласты эмбрионов кур и человека, перевиваемые клетки диплоидных фибробластов человека и культура мышиных клеток (L929).

При оценке противовирусного действия ИФН целесообразно использовать вирусы с коротким циклом размножения, высокой чувствительностью к действию ИФН: вирус энцефаломиелита мышей, везикулярного стоматита мыши и др.

Лабораторная работа 7-2

Определение активности интерферона

1. Взвесь диплоидных фибробластов плода человека на среде с 10% сывороткой эмбрионов коров (концентрация клеток - 15-20×10 6 /мл) разливают в стерильные 96-луночные плоскодонные планшеты по 100 мкл в лунку и помещают в СО 2 -инкубатор при температуре 37 °С.

2. После формирования полного монослоя из лунок удаляют ростовую среду и в каждую лунку добавляют по 100 мкл поддерживающей среды.

3. Титрование активности ИФН в исследуемых образцах проводят методом двукратных разведений на монослое фибробластов.

Одновременно с образцами в лунки вносят вирус энцефаломиелита мышей (ВЭМ) в дозе, вызывающей 100% поражение клеток через 48 ч после заражения.

4. Для контроля используют лунки с интактными (необработанными) клетками, зараженными вирусом.

В каждом исследовании в качестве референс-препаратов используют пробы референс-ИФН с известной активностью.

5. Планшеты с разведениями образца инкубируют 24 ч при температуре 37 °С в атмосфере с 5% содержанием СО 2 .

6. Уровень активности ИФН определяют величиной, обратной значению максимального разведения тестируемого образца, задерживающего цитопатическое действие вируса на 50%, и выражают ее в единицах активности на 1 мл.

7. Для определения типа ИФН в систему добавляют антисыворотку против ИФНα, ИФНβ или ИФНγ. Антисыворотка отменяет действие соответствующего цитокина, что позволяет идентифицировать тип ИФН.

Определение биологической активности миграции ингибирующего фактора. В настоящее время сформировались совершенно новые представления о природе и свойствах МИФ, открытого в 60-х годах прошлого столетия в качестве медиатора клеточного иммунитета и много лет остававшегося без должного внимания (Bloom B.R., Bennet В., 1966; David J.R., 1966). Лишь в последние 10-15 лет стало ясно: МИФ представляет собой один из важнейших биологических медиаторов в организме с широким спектром биологических функций цитокина, гормона, фермента. Действие МИФ на клетки-мишени реализуется через СD74 - -рецептор или через неклассический путь эндоцитоза.

МИФ рассматривают как важный медиатор воспаления, активирующий функцию макрофагов (выработку цитокинов, фагоцитоз, цитотоксичность и др.), а также как эндогенный иммунорегуляторный гормон, модулирующий глюкокортикоидную активность.

Накапливается все больше сведений о роли МИФ в патогенезе многих воспалительных заболеваний, включая сепсис, ревматоидный артрит (РА), гломерулонефрит и др. При РА значительно увеличена концентрация МИФ в жидкости пораженных суставов, коррелирующая с тяжестью заболевания. Под влиянием МИФ возрастает выработка провоспалительных цитокинов как макрофагами, так и синовиальными клетками.

Известны различные методы тестирования активности МИФ, когда мигрирующие клетки (клетки-мишени для МИФ) помещают в стеклянный капилляр (капиллярный тест), в каплю агарозы или в агарозный колодец.

Мы приводим сравнительно простой скрининговый метод, основанный на формировании на дне лунок 96-луночного плоскодонного планшета клеточных микрокультур (лейкоцитов или макрофагов), стандартных по площади и числу клеток, с последующим их культивированием в питательной среде и определением изменения площади этих микрокультур при действии МИФ (Суслов А.П., 1989).

Лабораторная работа 7-3

Определение МИФ-активности

Определение биологической активности МИФ проводят с помощью устройства для формирования клеточных микрокультур (рис. 7.7) - МИГРОСКРИН (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

1. В лунки 96-луночного планшета (Flow, Великобритания или аналогичные) добавляют по 100 мкл разведенной на культуральной среде пробы, в которой определяют МИФ-активность (каждое разведение в 4 параллелях, опытные пробы). Культуральная среда включает RPMI 1640, 2 mM L-глутамина, 5% сыворотки эмбриона коровы, 40 мкг/мл гентамицина.

2. В контрольные лунки добавляют культуральную среду (в 4 параллелях) по 100 мкл.

3. Готовят клеточную суспензию перитонеальных макрофагов, для чего 2 мышам-гибридам (СВАхС57В1/6)F1 внутрибрюшинно вводят по 10 мл раствора Хенкса с гепарином (10 ЕД/мл), осторожно массируют брюшко в течение 2-3 мин. Затем животное забивают декапитацией, осторожно прокалывают брюшную стенку в области паха и через иглу шприцем отсасывают экссудат. Клетки перитонеального экссудата дважды отмывают раствором Хенкса, центрифугируя их 10-15 мин при 200 g. Затем готовят суспензию клеток с концентрацией 10±1 млн/мл среды RPMI 1640. Подсчет проводят в камере Горяева.

4. Собирают систему МИГРОСКРИН, представляющую собой штатив для направленной и стандартной фиксации наконечников с клеточными культурами в строго вертикальном положении на заданной высоте над центром лунки 96-луночного культурального планшета, а также включающую 92 наконечника для автоматической пипетки фирмы «Costar», USA (рис. 7.7).

Вставляют ножки штатива в угловые лунки планшета. Клеточную суспензию набирают автоматической пипеткой в наконечники - по 5 мкл в каждый, ополаскивают от избытка клеток однократным опусканием в среду и вставляют вертикально в гнезда штатива системы. Заполненный штатив с наконечниками выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч на строго горизонтальной поверхности. За это время происходит оседание клеток суспензии на дно лунок, где формируются стандартные клеточные микрокультуры.

5. Штатив с наконечниками осторожно снимают с планшета. Планшет с микрокультурой клеток помещают в строго горизонтальном положении в СО 2 -инкубатор, где культивируют в течение 20 ч. В ходе культивирования клетки мигрируют по дну лунки.

6. Количественный учет результатов после инкубации проводят на бинокулярной лупе, визуально оценивая размер колонии по шкале внутри окуляра. Микрокультуры имеют форму круга. Затем исследователи определяют среднее значение диаметра колоний по результатам измерения колоний в 4 опытных или контрольных лунках. Погрешность измерения равна ±1 мм.

Индекс миграции (ИМ) рассчитывают по формуле:

Проба обладает МИФ-активностью, если значения ИМ равны

За условную единицу (ЕД) МИФ-активности принимают обратную величину, равную значению наибольшего разведения пробы (образца), при котором индекс миграции равен 0,6±0,2.

Биологическую активность ФЕO αоценивают по цитотоксическому его действию на линию трансформированных фибробластов L-929. В качестве положительного контроля используют рекомбинантный ФНОа, а в качестве отрицательного контроля - клетки в культуральной среде.

Вычисляют цитотоксический индекс (ЦИ):

где a - количество живых клеток в контроле; b - количество живых клеток в опыте.

Рис. 7.7. Схема МИГРОСКРИН - устройства для количественной оценки миграции клеточных культур

Клетки окрашивают красителем (метиленовым синим), который включается только в погибшие клетки.

За условную единицу активности ФНО принимают значение обратного разведения образца, необходимого для получения 50% клеточной цитотоксичности. Удельная активность образца - отношение активности в условных единицах на 1 мл к концентрации белка, содержащегося в образце.

Внутриклеточное окрашивание цитокинов. Изменение соотношения клеток, продуцирующих различные цитокины, может отражать патогенез заболевания и служить критерием прогноза заболевания и оценки проводимой терапии.

Методом внутриклеточного окрашивания определяют экспрессию цитокина на уровне одной клетки. Проточная цитофлуориметрия позволяет подсчитать количество клеток, экспрессирующих тот или иной цитокин.

Перечислим основные этапы определения внутриклеточных цитокинов.

Нестимулированные клетки продуцируют небольшие количества цитокинов, которые, как правило, не депонируются, поэтому важным этапом оценки внутриклеточных цитокинов являются стимуляция лимфоцитов и блокада выхода этих продуктов из клеток.

В качестве индуктора цитокинов чаще всего используют активатор протеинкиназы С форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) в комбинации с ионофором кальция иономицином (ИН). Применение такого сочетания вызывает синтез широкого спектра цитокинов: ИФНу, ИЛ-4, ИЛ-2, ФНОα. Недостаток использования ФМА-ИН - проблемы выявления CD4-молекул на поверхности лимфоцитов после такой активации. Также продукцию цитокинов Т-лимфоцитами индуцируют с помощью митогенов (ФГА). В-клетки и моноциты стимулируют

Мононуклеарные клетки инкубируют в присутствии индукторов продукции цитокинов и блокатора их внутриклеточного транспорта брефельдина А или моненсина в течение 2-6 ч.

Затем клетки ресуспендируют в буферном растворе. Для фиксации добавляют 2% формальдегид, инкубируют 10-15 мин при комнатной температуре.

Потом клетки обрабатывают сапонином, который повышает проницаемость клеточной мембраны, и окрашивают моноклональными антителами, специфичными к определяемым цитокинам. Предварительное окрашивание поверхностных маркеров (CD4, CD8) увеличивает количество получаемой информации о клетке и позволяет более точно определить ее популяционную принадлежность.

Имеются некоторые ограничения в применении описанных выше методов. Так, с их помощью невозможно анализировать синтез цитокинов единичной клеткой, невозможно определить количество цитокинпродуцирующих клеток в субпопуляции, невозможно определить, экспрессируют ли цитокинпродуцирующие клетки уникальные маркеры, синтезируются ли различные цитокины разными клетками или одними и теми же. Ответ на эти вопросы получают, используя другие методы исследования. Для определения частоты цитокин-продуцирующих клеток в популяции применяют метод лимитирующих разведений и вариант иммуноферментного анализа ELISPOT (см. гл. 4).

Метод гибридизации in situ. Метод включает:

2) фиксацию параформальдегидом;

3) выявление мРНК с помощью меченой кДНК. В некоторых случаях цитокиновую мРНК определяют на срезах с помощью радиоизотопной ПЦР.

Иммунофлюоресценция. Метод включает:

1) замораживание органа и приготовление криостатных срезов;

2) фиксацию;

3) обработку срезов меченными флюоресцеином антицитокиновыми антителами;

4) изуальное наблюдение флюоресценции.

Эти методики (гибридизация in situ и иммунофлюоресценция) быстры и не зависят от пороговых концентраций секретируемого продукта. Однако они не определяют количество секретированного цитокина и могут быть сложны технически. Необходим разнообразный тщательный контроль на неспецифические реакции.

С помощью представленных методов оценки цитокинов были выявлены патологические процессы, связанные с нарушениями в системе цитокинов на различных уровнях.

Таким образом, оценка системы цитокинов чрезвычайно важна для характеристики состояния иммунной системы организма. Изучение различных уровней системы цитокинов позволяет получить информацию о функциональной активности разных типов иммунокомпетентных клеток, о тяжести воспалительного процесса, о его переходе на системный уровень и о прогнозе заболевания.

Вопросы и задания

1. Перечислите общие свойства цитокинов.

2. Приведите классификацию цитокинов.

3. Перечислите основные компоненты системы цитокинов.

4. Перечислите клетки-продуценты цитокинов.

5. Охарактеризуйте семейства рецепторов цитокинов.

6. Каковы механизмы функционирования сети цитокинов?

7. Расскажите о выработке цитокинов в системе врожденного иммунитета.

8. Каковы основные подходы к комплексной оценке системы цитокинов?

9. Каковы методы тестирования цитокинов в биологических жидкостях организма?

10. Каковы дефекты в системе цитокинов при различных патологиях?

11. Каковы основные методы биологического тестирования ИЛ-1, ИФН, МИФ, ФНОа в биологических жидкостях?

12. Опишите процесс определения внутриклеточного содержания цитокинов.

13. Опишите процесс определения цитокинов, секретируемых единичной клеткой.

14. Опишите последовательность применяемых методов выявления дефекта на уровне рецептора цитокина.

15. Опишите последовательность методов, применяемых для выявления дефекта на уровне клеток-продуцентов цитокинов.

16. Какую информацию можно получить, исследуя выработку цитокинов в культуре мононуклеарных клеток, в сыворотке крови?

Введение

Общие сведения

Классификация цитокинов

Рецепторы цитокинов

Цитокины и регуляция иммунного ответа

Заключение

Литература

Введение

Цитокины – одна из важнейших частей иммунной системы. Иммунной системе необходима система оповещения от клеток организма, как крик о помощи. Это, пожалуй, лучшее определение цитокинов. Когда клетка повреждена или поражена патогенным организмом, макрофаги и поврежденные клетки выделяют цитокины. Сюда входят такие факторы, как интерлейкин, интерферон и фактор некроза опухоли-альфа. Последний также доказывает, что разрушение опухолевой ткани контролируется иммунной системой. Когда цитокины выделяются, они призывают особые иммунные клетки, например, лейкоциты и Т- и В-клетки.

Цитокины также дают сигнал о какой-то конкретной цели, которую данные клетки должны выполнить. Цитокины и антитела абсолютно различны, так как антитела – это то, что связано с антигенами, они позволяют иммунной системе идентифицировать вторжение инородных организмов. Таким образом, можно провести аналогию: цитокины являются главным сигналом тревоги для захватчиков, а антитела – разведчиками. Процесс анализа цитокинов называется определением цитокинов.

Общие сведения

Цитокины (cytokines) [греч. kytos - сосуд, здесь - клетка и kineo - двигаю, побуждаю] - большая и разнообразная группа небольших по размерам (молекулярная масса от 8 до 80 кДа) медиаторов белковой природы - молекул-посредников («белков связи»), участвующих в межклеточной передаче сигналов преимущественно в иммунной системе.

К цитокинам относят фактор некроза опухоли, интерфероны, ряд интерлейкинов и др. Цитокины, которые синтезируются лимфоцитами и являются регуляторами пролиферации и дифференцировки, в частности гематопоэтических клеток и клеток иммунной системы, называют лимфокинами.

Все клетки иммунной системы имеют определенные функции и работают в четко согласованном взаимодействии, которое обеспечивается специальными биологически активными веществами - цитокинами - регуляторами иммунных реакций. Цитокины - это специфические белки, с помощью которых разнообразные клетки иммунной системы могут обмениваться друг с другом информацией и осуществлять координацию действий.

Набор и количества цитокинов, действующих на рецепторы клеточной поверхности, - "цитокиновая среда" - представляют собой матрицу взаимодействующих и часто меняющихся сигналов. Эти сигналы носят сложный характер из-за большого разнообразия цитокиновых рецепторов и из-за того, что каждый из цитокинов может активировать или подавлять несколько процессов, включая свой собственный синтез и синтез других цитокинов, а также образование и появление на поверхности клеток цитокиновых рецепторов.

Межклеточная сигнализация в иммунной системе осуществляется путем непосредственного контактного взаимодействия клеток или с помощью медиаторов межклеточных взаимодействий. При изучении дифференцировки иммунокомпетентных и гемопоэтических клеток, а также механизмов межклеточного взаимодействия, формирующих иммунный ответ, и была открыта большая и разнообразная группа растворимых медиаторов белковой природы - молекул-посредников ("белков связи"), участвующих в межклеточной передаче сигналов - цитокинов.

Гормоны обычно исключают из этой категории на основании эндокринного (а не паракринного или аутокринного) характера их действия. (см. Цитокины: механизмы проведения гормонального сигнала). Вместе с гормонами и нейромедиаторами они составляют основу языка химической сигнализации, путем которой в многоклеточном организме регулируется морфогенез и регенерация тканей.

В положительной и отрицательной регуляции иммунного ответа им принадлежит центральная роль. К настоящему времени у человека обнаружено и изучено в той или иной степени, как уже упоминалось выше, более ста цитокинов, и постоянно появляются сообщения об открытии новых. Для некоторых получены генно-инженерные аналоги. Цитокины действуют через активацию рецепторов цитокинов.

А. Интерфероны (ИФН ):

1. Природные ИФН (1 поколение):

2. Рекомбинанатные ИФН (2 поколение):

а) короткого действия:

ИФН a2b: интрон-А

ИФН β: авонекс и др.

(пэгилированные ИФН): пэгинтерферон

Б. Индукторы интерферона (интерфероногены):

1. Синтетические – циклоферон, тилорон, дибазол и др.

2. Природные – ридостин и др.

В. Интерлейкины : рекомбинантный интерлейкин-2 (ронколейкин, альдеслейкин, пролейкин,) , рекомбинантный интерлейкин 1-бета (беталейкин).

Г. Колониестимулирующие факторы (молграмостим и др.)

Пептидные препараты

Препараты тимических пептидов .

Пептидные соединения, вы­рабатываемые вилочковой железой, стимулируют созревание Т-лимфоцитов (тимопоэтины).

При исходно пониженных показателях препараты типических пептидов повышают количество Т-клеток и их функциональную активность.

Родоначальником тимических препаратов первого поколения в России стал Тактивин , представляющий собой комплекс пептидов, экстрагированных из тимуса крупного рогатого скота. К препаратам, содержащим комплекс тимических пептидов, относятся также Тималин, Тимоптин и другие, а к содержащим экстракты тимуса – Тимостимулин и Вилозен .

Препараты пептидов из тимуса крупного рогатого скота тималин, тимостимулин вводят внутримышечно, а тактивин, тимоптин - под кожу в основном при недостаточности клеточного иммунитета:

При Т-иммунодефицитах,

Вирусных инфекциях,

Для профилактики инфекций при лучевой терапии и химиотерапии опухолей.

Клиническая эффективность тимических препаратов первого поколения не вызывает сомнения, но у них есть один недостаток: они представляют собой неразделенную смесь биологически активных пептидов, достаточно трудно поддающихся стандартизации.

Прогресс в области лекарственных средств тимического происхождения шел по линии создания препаратов II и III поколений – синтетических аналогов природных гормонов тимуса или фрагментов этих гормонов, обладающих биологической активностью.

Современный препарат Имунофан – гексапептид, синтетический аналог активного центра тимопоэтина, применяют при иммунодефицитах, опухолях. Препарат стимулирует образование ИЛ-2 иммунокомпетентными клетками, повышает чувствительность лимфоидных кле­ток к этому лимфокину, снижает продукцию ФНО (фактора некроза опухолей), оказывает регулирующее вли­яние на выработку медиаторов иммунитета (воспаления) и иммуноглобулинов.

Препараты пептидов костного мозга

Миелопид получают из культуры клеток костного мозга млекопитающих (телят, свиней). Ме­ханизм действия препарата связан со стимуляцией пролиферации и функциональ­ной активности В- и Т-клеток.

В организме мишенью этого препарата считаются В-лимфоциты. При нарушении иммуно- или гемопоэза введение миелопида ведет к усилению общей митотической активности клеток костного мозга и направлению их дифференцировки в сторону зрелых В-лимфоцитов.

Миелопид применяют в комплексной терапии вторичных иммуно­дефицитных состояний с преимущественным поражением гуморального звена им­мунитета, для профилактики инфекционных осложнений после хирургических вмешательств, травм, перенесенного остеомиелита, при неспецифических легоч­ных заболеваниях, хронических пиодермиях. Побочные эффекты препарата - головокружение, слабость, тошнота, гиперемия и болезненность в месте введения.

Все препараты этой группы противопоказаны беременным, миелопид и имунофан противопоказаны при наличии резус-конфликта матери и плода.

Препараты иммуноглобулинов

Иммуноглобулины человека

а) Иммуноглобулины для внутримышечного введения

Неспецифические: иммуноглобулин человека нормальный

Специфические: иммуноглобулин против гепатита В человека, иммуноглобулин человека антистафилококковый, иммуноглобулин человека противостолбнячный, иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, иммуноглобулин человека против вируса бешенства и др.

б)Иммуноглобулины для внутривенного введения

Неспецифические: иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения (габриглобин, иммуновенин, интраглобин, хумаглобин)

Специфические: иммуноглобулин против гепатита В человека (неогепатект), пентаглобин (содержит антибактериальные IgM, IgG, IgA), иммуноглобулин против цитомегаловируса (цитотект), иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита, антирабический ИГ и др..

в)Иммуноглобулины для перорального применения: иммуноглобулиновый комплексный препарат (КИП) для энтерального применения при острых кишечных инфекциях; антиротавирусный иммуноглобулин для перорального введения.

Гетерологичные иммуноглобулины:

иммуноглобулин антирабический из сыворотки лошади, сыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная и др.

Препараты неспецифических иммуноглобулинов применяют при первичных и вторичных иммунодефицитах, препараты специфических иммуноглобулинов – при соответствующих инфекциях (с лечебной или профилактической целью).

Цитокины и препараты на их основе

Регуляция развившегося иммунного ответа осуществляется цитокинами – сложным комплексом эндогенных иммунорегуляторных молекул , которые являются основой для создания большой группы как естественных, так и рекомбинантных иммуномодулируюших препаратов.

Интерфероны (ИФН):

1. Природные ИФН (1 поколение):

Альфафероны: человеческий лейкоцитарный ИФН и др.

Бетафероны: человеческий фибробластный ИФН и др.

2. Рекомбинанатные ИФН (2 поколение):

а) короткого действия:

ИФН a2а: реаферон, виферон и др.

ИФН a2b: интрон-А

ИФН β: авонекс и др.

б) пролонгированного действия (пэгилированные ИФН): пэгинтерферон (ИФН a2b+Полиэтиленгликоль) и др.

Основная направленность действия препаратов ИФН – Т-лимфоциты (естественные киллеры и цитотоксические Т-лимфоциты).

Природные интерфероны получают в культуре клеток лейкоцитов донорс­кой крови (в культуре лимфобластоидных и других клеток) под воздействием вируса-индуктора.

Рекомбинантные интерфероны получают генно-инженерным методом - путем культивирования бактериальных штаммов, содержащих в своем гене­тическом аппарате встроенную рекомбинантную плазмиду гена интерферона человека.

Интерфероны оказывают противовирусное, противоопухолевое и иммуномодулирующее действие.

Как противовирусные средства препараты интерферона наиболее эффективны при лечении герпетических заболеваний глаз (местно в виде капель, субконъюнктивально), простого герпеса с локализацией на коже, слизистых оболочках и гени­талиях, опоясывающего лишая (местно в виде мази на гидрогелевой основе), ос­трого и хронического вирусного гепатита В и С (парентерально, ректально в суппозиториях), при лечении и профилактике гриппа и ОРВИ (интраназально в форме капель). При ВИЧ-инфекции препараты рекомбинантного интерферона нормализуют иммунологические параметры, снижают остроту течения заболева­ния более чем в 50% случаев, вызывают уменьшение уровня виремии и содержа­ния сывороточных маркеров заболевания. При СПИДе проводят комбинирован­ную терапию с азидотимидином.

Противоопухолевое действие препаратов интерферона связано с антипроли-феративным эффектом и стимуляцией активности естественных киллеров. Как противоопухолевые средства применяются ИФН-альфа, ИФН-аль­фа 2а, ИФН-альфа-2b, ИФН-альфа-n1, ИФН-бета.

В качестве иммуномодулятора при рассеянном склерозе применяется ИФН-бета-lb.

Препараты интерферонов вызывают сходные побочные эффекты . Характер­ны - гриппоподобный синдром; изменения со стороны ЦНС: головокружение, нарушение зрения, спутанность сознания, депрессия, бессонница, парестезии, тремор. Со стороны желудочно-кишечного тракта: по­теря аппетита, тошнота; со стороны сердечно-сосудистой системы возможно про­явление симптомов сердечной недостаточности; со стороны мочевыделительной системы - протеинурия; со стороны системы кроветворения - преходящая лей­копения. Также могут возникнуть сыпь, зуд, алопеция, временная импотенция, носовые кровотечения.

Индукторы интерферона (интерфероногены):

1. Синтетические – циклоферон, тилорон, полудан и др.

2. Природные – ридостин и др.

Индукторы интерферона - это препараты, усиливающие синтез эндогенного интерферона. Эти препараты имеют ряд преимуществ по сравнению с рекомбинантными интерферонами. Они не обладают антигенной активностью. Стимули­рованный синтез эндогенного интерферона не вызывает гиперинтерферонемии.

Тилорон (амиксин) относится к низкомолекулярным синтетическим соединениям, является пероральным индуктором интерферона. Обладает широким спектром противовирусной активности в отношении ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Как противовирусное и иммуномодулирующее средство применяется для профи­лактики и лечения гриппа, ОРВИ, гепатита А, для лечения вирусных гепатитов, герпеса простого (в том числе урогенитального) и опоясывающего, при комплек­сной терапии хламидийных инфекций, нейровирусных и инфекционно-аллергических заболеваний, при вторичных иммунодефицитах. Препарат хорошо переносится. Возможны диспептические явления, кратковременный озноб, по­вышение общего тонуса, что не требует отмены препарата.

Полудан представляет собой биосинтетический полирибонуклеотидный комплекс полиадениловой и полиуридиловой кислот (в эквимолярных соотно­шениях). Препарат оказывает выраженное ингибирующее влияние на вирусы про­стого герпеса. Применяется в виде глазных капель и инъекций под конъюнктиву. Препарат назначают взрослым для лечения вирусных заболеваний глаз: герпети­ческих и аденовирусных конъюнктивитов, кератоконъюнктивитов, кератитов и кератоиридоциклитов (кератоувеитов), иридоциклитов, хориоретинитов, неври­тов зрительного нерва.

Побочные эффекты возникают редко и проявляются развитием аллергичес­ких реакций: зуд и ощущение инородного тела в глазу.

Циклоферон - низкомолекулярный индуктор интерферона. Оказывает противовирусное, иммуномодулирующее и противовоспалительное действие. Циклоферон эффективен в отношении вирусов клещевого энцефалита, герпеса, цитомегаловируса, ВИЧ и др. Обладает антихламидийным действием. Эффекти­вен при системных заболеваниях соединительной ткани. Установлено радиоза­щитное и противовоспалительное действие препарата.

Арбидол назначают внутрь для профилактики и лечения гриппа и других ОРВИ, а также при герпетических заболеваниях.

Интерлейкины:

рекомбинантный ИЛ-2 (альдеслейкин, пролейкин, ронколейкин) , рекомбинантный ИЛ-1бета (беталейкин ).

Для цитокиновых препаратов естественного происхождения, содержащих достаточно большой набор цитокинов воспаления и первой фазы иммунного ответа, характерно многогранное воздействие на организм человека. Эти препараты действуют на клетки, участвующие в воспалении, процессах регенерации и иммунном ответе.

Альдеслейкин - рекомбинантный аналог ИЛ-2. Оказывает иммуномодулирующее и противоопухолевое действие. Активирует клеточный иммунитет. Усиливает пролиферацию Т-лимфоцитов и ИЛ-2-зависимых клеточных популяций. Повышает цитотоксичность лимфоцитов и клеток - киллеров, которые распознают и уничтожают клетки опухоли. Усиливает продукцию гамма-интерферона, ФНО, ИЛ-1. Применяется при раке почек.

Беталейкин - рекомбинантный человеческий ИЛ-1 бета. Сти­мулирует лейкопоэз и иммунную защиту. Вводят под кожу или внутривенно при гнойных процессах с иммунодефи­цитом, при лейкопении в результате химиотерапии, при опухолях.

Ронколейкин - рекомбинантный препарат интерлейкина-2 -вводят внутривенно при сепсисе с иммунодефицитом, а также при раке почки.

Колониестимулирующие факторы:

Молграмостим (Лейкомакс) - рекомбинантный препарат человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Стимулирует лейкопоэз, обладает иммунотропной актив­ностью. Усиливает пролиферацию и дифференцировку предшественников, увеличивает содержание зрелых клеток в периферической крови, рост гранулоцитов, моноцитов, макрофагов. Повышает функциональную активность зрелых нейтрофилов, усиливает фагоцитоз и окислительный метаболизм, обеспечиваю­щий механизмы фагоцитоза, повышает цитотоксичность в отношении злокаче­ственных клеток.

Филграстим (Нейпоген) - рекомбинантный препарат человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего факто­ра. Филграстим регулирует продукцию нейтрофилов и их поступление в кровь из костного мозга.

Ленограстим - рекомбинантный препарат человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Представляет со­бой высокоочищенный протеин. Является иммуномодулятором и стимулятором лейкопоэза.

Синтетические иммуностимуляторы: левамизол, изопринозин полиоксидоний, галавит.

Левамизол (декарис), производным имидазола, применяют в качестве иммуностимулятора, а также в качестве противоглистного средства при аскаридозе. Иммуностимулирующие свойства левамизола связывают с повышением активности макрофагов и Т-лимфоцитов.

Левамизол назначают внутрь при рецидивирующих герпетических инфекциях, хроническом вирусном гепатите, аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, болезнь Крона). Препарат применяют также при опухолях толстого кишечника после хирургической, лучевой или лекарственной терапии опухолей.

Изопринозин - препарат, содержащий инозин. Стимулирует активность макрофагов, продукцию интерлейкинов, пролиферацию Т-лимфоцитов.

Назначают внутрь при вирусных инфекциях, хронических инфекциях дыхательных и мочевыводящих путей, иммунодефицитах.

Полиоксидоний - синтетическое водорастворимое полимерное соеди­нение. Препарат обладает иммуностимулирующим и детоксицирующим действи­ем, увеличивает иммунную резистентность организма в отношении локальных и генерализованных инфекций. Полиоксидоний активирует все факторы естествен­ной резистентности: клетки моноцитарно-макрофагальной системы, нейтрофилы и естественные киллеры, повышая их функциональную активность при ис­ходно сниженных показателях.

Галавит – производное фталгидразида. Особенность этого препарата заключается в наличии не только иммуномодулирующих, но и выраженных противовоспалительных свойств.

Препараты других фармакологических классов с иммуностимулирующей активностью

1. Адаптогены и препараты растительного происхождения (фитопрепараты): препараты эхинацеи (иммунал), элеутерококка, женьшеня, родиолы розовой и др.

2. Витамины: кислота аскорбиновая (витамин С), токоферола ацетат (витамин Е), ретинола ацетат (витамин А) (см. раздел «Витамины»).

Препараты эхинацеи обладают иммуностимулирующими и противовоспалительными свойствами. При приеме внутрь эти препараты повышают фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов, стимулируют продукцию интерлейкина-1, активность Т-хелперов, дифференцировку В-лимфоцитов.

Применяют препараты эхинацеи при иммунодефицитах и хронических воспалительных заболеваниях. В частности, иммунал назначают внутрь в каплях для профилактики и лечения острых респираторных инфекций, а также совместно с антибактериальными средствами при инфекциях кожи, дыхательных и мочевыводящих путей.

Общие принципы применения иммуностимуляторов у больных с вторичными иммунодефицитами

Наиболее обоснованным применение иммуномостимуляторов представляется при иммунодефицитах, проявляющихся повышенной инфекционной заболеваемостью. Главной мишенью иммуностимулирующих препаратов остаются вторичные иммунодефициты, которые проявляются частыми рецидивирующими, трудно поддающимися лечению инфекционно-воспалительными заболеваниями всех локализаций и любой этиологии. В основе каждого хронического инфекционно-воспалительного процесса лежат изменения в иммунной системе, которые являются одной из причин персистенции этого процесса.

· Иммуномодуляторы назначают в комплексной терапии одновременно с антибиотиками, противогрибковыми, противопротозойными или противовирусными средствами.

· При проведении иммунореабилитационных мероприятий, в частности при неполном выздоровлении после перенесенного острого инфекционного заболевания, иммуномодуляторы можно применять в виде монотерапии.

· Применять иммуномодуляторы целесообразно на фоне иммунологического мониторинга, который следует осуществлять вне зависимости от наличия или отсутствия исходных изменений в иммунной системе.

· Иммуномодуляторы, действующие на фагоцитарное звено иммунитета, можно назначать больным как с выявленными, так и с невыявленными нарушениями иммунного статуса, т.е. основанием для их применения является клиническая картина.

Понижение какого-либо параметра иммунитета, выявленное при иммунодиагностическом исследовании у практически здорового человека, не обязательно является основанием для назначения ему иммуномодулирующей терапии.

Контрольные вопросы:

1. Что такое иммуностимуляторы, какие бывают показания к проведению иммунотерапии, на какие виды подразделяют иммунодефицитные состояния?

2. Классификация иммуномодуляторов по преимущественной изберательности действия?

3. Иммуностимуляторы микробного происхождения и их синтетические аналоги, их фармакологичекие свойства, показания к применения, противопоказания, побочные эффекты?

4. Эндогенные иммуностимуляторы и их синтетические аналоги, их фармакологичекие свойства, показания к применения, противопоказания, побочные эффекты?

5. Препараты тимических пептидов и пептидов костного мозга их фармакологичекие свойства, показания к применения, противопоказания, побочные эффекты?

6. Препараты иммуноглобулинов и интерфероны (ИФН), их фармакологичекие свойства, показания к применения, противопоказания, побочные эффекты?

7. Препараты индукторов интерферона (интерфероногены), их фармакологичекие свойства, показания к применения, противопоказания, побочные эффекты?

8. Препараты интерлейкинов и колониестимулирующих факторов, их фармакологичекие свойства, показания к применения, противопоказания, побочные эффекты?

9. Синтетические иммуностимуляторы их фармакологичекие свойства, показания к применения, противопоказания, побочные эффекты?

10. Препараты других фармакологических классов с иммуностимулирующей активностью и общие принципы применения иммуностимуляторов у больных с вторичными иммунодефицитами?

«Система цитокинов. Классификация. Основные
свойства. Механизмы действия. Типы цитокиновой
регуляции. Клетки-продуценты и клетки-мишени.
Цитокиновая регуляция воспаления и иммунного
ответа».
Цикл 1 – иммунология.
Занятие № 3 а.

Цитокины

Сигнальные (биорегуляторные) молекулы,
управляющие практически всеми процессами в
организме – эмбриогенезом, гемопоэзом,
процессами созревания и дифференцировки
клеток, активации и гибели клеток, инициацией и
поддержанием разных типов иммунного ответа,
развитием воспаления, процессами репарации,
ремоделирования тканей, координацией работы
иммуно – нейро - эндокринной систем на уровне
организма в целом.

Цитокины

Растворимые гликопротеины (более 1300 молекул, 550 кDa) неиммуноглобулиновой природы,
освобождаемые клетками организма – хозяина,
обладающие неферментативным действием в низких
концентрациях (от пикомолярных до наномолярных),
действующие через специфические рецепторы на
клетках-мишенях, регулирующие различные функции
клеток организма.
В настоящее время известно около 200 цитокинов.

Цитокины и жизненный цикл
клеток
Цитокины –биорегуляторные
молекулы, контролирующие
разные этапы жизненного цикла
клеток:
процессы дифференцировки.
процессы пролиферации.
процессы функциональной
активации.
процессы гибели клеток.
Цитокины и иммунный ответ
Цитокины играют важную роль в
осуществлении реакций как
врожденного, так и
адаптивного иммунитета.
Цитокины обеспечивают
взаимосвязь врожденного и
адаптивного иммунных
ответов.

Свойства цитокинов

Характерен короткий период
полужизни:
цитокины быстро
инактивируются и
разрушаются.
Большинство из цитокинов
действует на местном уровне
(паракринно – на клетки
микроокружения).
Цитокинов больше, чем их
рецепторов (многие цитокины
используют общие
субъединицы рецепторов) на
клетках-мишенях для
передачи сигналов в ядро
клетки-мишени
Плейотропность – единственная
молекула может вызывать
множество эффектов путем
активации различных генов в
клетках-мишенях
Конвергенция функций – разные
цитокиновые молекулы могут
выполнять в организме
сходные функции
Полисферизм – множество
цитокинов могут
продуцироваться одной и той
же клеткой в ответ на один
стимул

Плейотропность цитокинов на примере интерферона-гамма

гранулоциты
эндотелий
активация
активация
Секреция
интерферонагамма
макрофаги
активация
NK
активация
многие типы клеток
повышение
противовирусной
активности
активация Т клеток
многие типы клеток
дифференцировка
В клеток
индукция экспрессии
MHC I или MHCII

Типы цитокиновой регуляции

Паракринная регуляция (в
большинстве случаев
цитокины действуют местно,
в очаге воспаления).
Аутокринная регуляция –
цитокин производится
клеткой, к нему клеткапроизводитель данного
цитокина экспрессирует
рецепторы, вследствие этого
цитокин действует на клетку,
его производящую.
Эндокринная регуляция –
отставленное действие:
интерлейкин 1 –бета –
эндогенный пироген
(действует на центр
терморегуляции в головном
мозге),
интерлейкин 6 действует на
гепатоциты, вызывая синтез
белков острой фазы,
ростовые факторы
действуют на костный мозг,
активируют гемопоэз и т.д.

10. Представление о системе цитокинов в клинической практике

Для клинической практики важно
отследить основную цепь
взаимодействий в
иммунопатогенезе
заболеваний:
1. Клетки- продуценты
цитокинов.
2. Цитокины и их антагонисты.
3. Клетки-мишени,
экспрессирующие рецепторы
цитокинов.
4. Производимые цитокинами
эффекты на уровне организма.
Цель: разработка и внедрение в
практику новых стратегий
терапии заболеваний:
цитокиновая терапия
(применение в клинике
препаратов цитокинов),
либо
антицитокиновая терапия
(применение в клинике
антагонистов цитокинов или
моноклональных антител к
цитокинам).

11. Основные типы цитокинов –общепринятые сокращения: интерлейкины

В более ранних
классификациях цитокинов
использовалось их деление
по принципу клеток,
синтезирующих цитокины:
лимфокины (цитокины,
секретируемые в основном
активированными Т
лимфоцитами –хелперами)
и
монокины (цитокины,
секретируемые клетками
моноцитарномакрофагал.ьного ряда)
Такой подход не всегда оправдан,
так как для цитокинов
характерно частичное
перекрывание функций.
Вследствие этого был введен
единый термин «интерлейкины»
IL (или ИЛ):
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,1
5,16,17 …..35
Термин «интерлейкины» означает
«молекулы, участвующие во
взаимоотношениях, «беседах»
между лейкоцитами».

12. Основные типы цитокинов –общепринятые сокращения:

факторы некроза опухолей
(ФНО или TNF)
TNF - (кахектин)
TNF- (лимфотоксин)
Интерфероны (ИФН или IFN)
IFN и IFN
IFN
трансформирующие ростовые
факторы:
Трансформирующий
ростовый фактор –альфа –
TGF -
Трансформирующий
ростовый фактор –бета –
TGF -
-хемокины:
IL-8
NAP -2 (neutrophil – activating
protein -2)
PF -4 (platelet factor 4)

13. Основные типы цитокинов –общепринятые сокращения:

Колониестимулирующие
факторы:
G -CSF - granulocyte colony
stimulating factor
GM - CSF – granulocyte macrophage colony stimulating
factor
M - CSF - macrophage colony
stimulating factor
Multi - CSF - IL - 3
«Лимфокины» – секретируются в
основном активированными Т h
клетками:
MAF - macrophage activating
factor
MCF - macrophage chemotactic
factor
MMIF-macrophage migration
inhibition factor
LMIF- leukocyte migration
inhibition factor

14. Основные типы цитокинов –общепринятые сокращения:

Полипептидные ростовые
факторы клеток:
a FGF – acidic fibroblast
growth factor
b FGF – basic fibroblast
growth factor
EGF – epidermal growth
factor
NGF – nerve growth factor
PDGF – platelet - derived
growth factor
VEGF – vascular endothelial
growth factor
Современные отечественные книги и
журналы

15. Классификация цитокинов на основе их биологических эффектов

1. Интерлейкины (ИЛ-1 ÷
ИЛ- 35) - сигнальные
молекулы,
действующие между
лейкоцитами.
2. Факторы некроза
опухоли - цитокины с
цитотоксическим и
регуляторным
действием (ФНО).
3. Интерфероны –
противовирусные
цитокины:
1 типа –ИФН α,β и др.
2 типа –ИФН γ
4. Факторы роста стволовых клеток (ИЛ-3, ИЛ
-7, ИЛ-11, эритропоэтин, тромбопоэтин,
колониестимулирующие факторы (КСФ): ГМКСФ (гранулоцитарно-макрофагальный
колониестимулирующий фактор), Г-КСФ
(гранулоцитарный КСФ), М-КСФ
(макрофагальный КСФ), регулирующие
гемопоэз.
5. Хемокины (CC, CXC (ИЛ-8), CX3C, С) ,
регулирующие хемотаксис различных клеток.
6.Факторы роста клеток (фактор роста
фибробластов, фактор роста
эндотелиальных клеток, фактор роста
эпидермиса и др.), трансформирующий
ростовый фактор - участвуют в регуляции
роста, дифференцировки разных клеток.

16. Классификация цитокинов на основе их роли в процессе регуляции воспаления

Провоспалительные
Синтезируются
преимущественно
активированными клетками
моноцитарно/макрофагально
го ряда и повышают
активность воспалительного
процесса.
Провоспалительных цитокинов
намного больше, чем
противовоспалительных.
Противовоспалительные
В основном, Т- клеточные
цитокины, снижающие
активность воспаления –
ИЛ-10,
ТГФ β (трансформирующий
фактор роста бета);
а также -рецепторный
антагонист интерлейкина-1
(РАИЛ).

17. Цитокины с регуляторной (противовоспалительной) активностью

цитокин
эффект
ИЛ-10
подавляет продукцию
цитокинов, подавляет
активацию Т-хелперов 1 типа
ТРФ - бета 1
(трансформирующий
ростовый фактор-бета 1)
подавляет активацию Тхелперов 1 и 2 типа,
стимулирует рост
фибробластов

18. 1. Цитокины врожденного иммунитета

Основные клеткипродуценты – клетки
миелоидного
происхождения.
После активации
образраспознающих
рецепторов
запускается
внутриклеточный
сигнальный каскад,
приводящий к
активации генов
провоспалительных
цитокинов и
интерферонов 1 типа
(α ; β и др.).

19. РАСПОЗНАВАНИЕ ПАТОГЕНОВ РЕЦЕПТОРАМИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА

Патогены
Патоген-ассоциированные
молекулярные структуры или паттерны
(РАМРs)
Паттерн распознающие рецепторы (PRRs):
1. Растворимые (система комплемента)
2. Мембранные (TLRs –Толл- подобные рецепторы, CD14)
3. Внутриклеточные (NOD и др.).

20.

Сигнальные пути Толл-подобных рецепторов
Димеры Толл-подобных рецепторов
Клеточная
мембрана
TIR-домены
MyD88
IRAK-1
TRIF
IRAK-4
TRAF6
TAK1
IKKa
JNK
TBK
1
IKKb
IRF3
AP-1
NFkB
Экспрессия генов цитокинов семейства ИЛ-1,
провоспалительных цитокинов и хемокинов
АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ ЗАЩИТА
Экспрессия генов интерферона
АНТИВИРУСНАЯ ЗАЩИТА

21. Функциональная активность провоспалительных цитокинов в зависимости от их концентрации –местное и системное действие

На местном уровне
Самым ранним эффектом
провоспалительных цитокинов
является повышение адгезивных
свойств эндотелия и привлечение
активированных клеток в очаг
воспаления из периферической
крови.
Провоспалительные цитокины
управляют местным воспалением с
его типичными проявлениями
(отек, покраснение, появление
болевого синдрома).
На системном уровне
При повышении концентрации
провоспалительных
цитокинов в крови,
они действуют практически на
все органы и системы,
участвующие в
поддержании гомеостаза
Примером зависимости эффектов провоспалительных цитокинов от их
концентрации в крови может служить фактор некроза опухолей-альфа

22.

УРОВНИ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ
10-7 М
ФНО
10-8 М
10-9 М
Местное воспаление
Системная
воспалительная
реакция
Септический шок
Активация фагоцитоза и
продукции кислородных
радикалов. Усиление
экспрессии молекул
адгезии на эндотелии.
Стимуляция синтеза
цитокинов и хемокинов.
Увеличение метаболизма
соединительной ткани.
Лихорадка.
Увеличение уровней
стероидных гормонов.
Лейкоцитоз.
Увеличение синтеза
остро-фазовых
белков.
Снижение сократимос-ти
миокарда и гладкомышечных клеток сосудов.
Увеличение проницаемости
эндотелия. Нарушение
микроциркуляции. Падение
артериального давления.
Гипогликемия.

23. Роль некоторых цитокинов в патогенезе воспалительных реакций: Усиление реакций врожденного иммунного ответа

цитокин
эффект
ИЛ-6
Острофазовый ответ (действие на гепатоциты)
ИЛ-8
Фактор хемотаксиса нейтрофилов и других лейкоцитов
Фактор некроза
опухолей –
альфа(ФНО α)
Активирует нейтрофилы, клетки эндотелия, гепатоциты
(продукция белков острой фазы), катаболический
эффект – приводит к кахексии
Интерферональфа (ИФНα)
Активирует макрофаги, клетки эндотелия, естественные
киллеры

24. Интерлейкин-1-бета: свойства

Клетка - мишень
Эффект
Макрофаги,
фибробласты,
остеобласты,
эпителий
Пролиферация, активация
Остеокласты
Усиление процессов реабсорбции в костях
Гепатоциты
Синтез белков острой фазы воспаления
Клетки
гипоталамуса
Синтез простагландинов и последующий
подъем температуры тела

25. Интерлейкин-1-бета: свойства

Клетка-мишень
Эффект
Т-лимфоциты
Пролиферация, дифференцировка,
синтез и секреция цитокинов,
повышение уровня экспрессии
рецепторов к ИЛ-2
В-лимфоциты
Пролиферация, дифференцировка
Нейтрофилы
Высвобождение из костного мозга,
хемотаксис, активация
Эндотелий
Активация экспрессии молекул адгезии

26. Биологический смысл действия цитокинов при системном воспалении

На уровне целостного
организма цитокины
осуществляют связь между
иммунной, нервной,
эндокринной, кроветворной и
другими системами
регуляции гомеостаза и
служат для их вовлечения в
организацию единой
защитной реакции.
Цитокины обеспечивают
«сигнал тревоги»,
означающий, что настало
время включить все резервы,
переключить энергетические
потоки и перестроить работу
всех систем для выполнения
одной, но важнейшей для
выживания задачи – борьбы
с внедрившимся патогеном.
Примером множественности эффектов провоспалительных цитокинов
в запуске системного воспаления может служить интерлейкин 1 бета

27.

INFα
IL-6
IL-12,IL-23
TNFα
IL-1β
IL-8
Синтез цитокинов
Регуляция
температуры,
поведения,
синтеза гормонов
Активация лимфоцитов
IL-1β
Экспрессия молекул
адгезии на эндотелиоцитах,
прокоагулянтная активность,
синтез цитокинов
Продукция белков
острой фазы воспаления
PG
Активация
кроветворения
LT
NO
Активация фагоцитоза
Активация iNOS и метаболизма
арахидоновой кислоты

28. IL-1 и TNF-

IL-1 и TNF-
Интерлейкин -1 – бета(IL-1)
и фактор некроза
опухолей –альфа (TNF-)
играют основную роль в
воспалительных ответах,
так как введение
рецепторного антагониста
интерлейкина 1(IL -1 ra) , а
также моноклональных
антител или растворимых
рецепторов TNF-
блокирует острые и
хронические
воспалительные ответы в
экспериментах на
животных.
.
Некоторые их таких
антагонистов и
моноклональных
антител уже
используются в
клинике – например,
при лечении сепсиса,
ревматоидного
артрита, системной
красной волчанки и
других заболеваний
человека.

29. Ростовые факторы

цитокин
ГМ-КСФ
(гранулоцитарно-макрофагальный
колониестимулирующий фактор)
М-КСФ
(Макрофаг- колониестимулирующий
фактор)
Г-КСФ
(Гранулоцит- колониестимулирующий
фактор)
эффект
стимулируют рост и
дифференцировку
клетокпредшественников
моноцитов и
полиморфноядерных лейкоцитов

30.

31.

РЕГУЛЯЦИЯ ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА
Цитокины – ростовые и дифференцировочные
факторы всех типов Т- и В-лимфоцитов
Главные функции: регуляция дифференцировки Т-хелперных клонов определение типов тканевого воспаления, Т-клеток эффекторов и классов антител
Тh1 – клеточный тип с участием макрофагов
и Т-лимфоцитов (гранулема

При туберкулезе; при саркоидозе, контактном дерматите, болезни Крона)
Тh2 – аллергический тип ответа с участием гистамина и простагландинов
Т h 17 – нейтрофильное воспаление
Tfn (фолликулярные Т хелперы)- гуморальный иммунный ответ
T reg –T h регуляторный (ограничение силы всех типов иммунного ответа и
воспаления)