Определение свежести. Биохимические исследования мяса. Определение свежести Реакция на пероксидазу в мясе животных

Исследование мяса больных и вынужденно-убитых животных

Известно, что мясо и продукты убоя, полученные от больных животных, могут являться источником заражения человека зооантропонозными болезнями и возникновения пищевых заболеваний. Поэтому главной задачей ветеринарного специалиста является обеспечение выпуска мяса и мясопродуктов, безопасных для жизни и здоровья людей.

К убою допускаются здоровые животные, прошедшие плановые ди­агностические исследования, из населенных пунктов, благополучных по инфекционным болезням. Животные, направляемые для убоя, под­лежат ветеринарному осмотру с выборочной термометрией по усмо­трению ветеринарного врача.

Убой животных, больных и подозрительных по заболеванию зараз­ными болезнями или находящихся под угрозой гибели (тяжелые трав­мы, переломы, ожоги и другие повреждения), разрешается в случаях, предусмотренных соответствующими инструкциями, а также Прави­лами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-сани-тарной экспертизы мяса и мясопродуктов (от 1988 г.).

Следует помнить, что нередки случаи, когда поставщики мяса умышленно пытаются реализовать мясо, полученное от трупов, боль­ных и убитых в агональном состоянии животных. Поэтому одной из важнейших задач ветсанэксперта является выявление мяса больных животных и трупов. Для решения этой задачи используют комплекс мероприятий, состоящий из изучения сопроводительных документов (ветеринарное свидетельство или справка и др.), органолептических и лабораторных исследований.

Цель занятия: отработать методики определения мяса больных жи­вотных; установить от какого животного было получено мясо: здоро­вого, больного или трупа.

План работы:

1. Изучить сопроводительные документы на мясо.

2. Провести органолептическое исследование мяса, лимфатических узлов внутренних органов и мясного бульона 1: 3.

3. Провести физико-химическое исследование мяса (определение рН, реакция на пероксидазу, формольная проба, реакция с серно­кислой медью).

4. Приготовить мазки-отпечатки из глубоких слоев мяса, лимфоуз­лов и органов, окрасить их по Граму и по Ольту и провести микро­скопию.

5. Оформить протокол исследования и на основании результатов органолептических и лабораторных исследований и изучения со­проводительных документов дать ветеринарно-санитарную оцен­ку мяса.

Материальное обеспечение: часы песочные на 2 мин, колбы термо­стойкие на 100 мл с крышкой и на 200 мл (2 шт.), стеклянные палочки, пипетки 2 и 5 мл, груша, воронки, ватный фильтр, бумажный фильтр, мерный цилиндр на 100 мл, бюретка, штатив, ступка, пестик, эмали­рованная кювета, ножницы, анатомический пинцет, скальпель, мик­роскоп, пробирки (10 шт.), предметные стекла, бактериологическая петля, бактериологический мостик, простоквашница, газовая горелка (спиртовка), пробы мяса по 100 г от здоровых, больных животных и трупов (комплект на 2-3 человек), весы аналитические (точность - 0,01 г), рН-метр цифровой, набор Михаэлиса, плитка электрическая, водяная баня, вода дистиллированная, 5% раствор сернокислой меди, 0,2% раствор бензидина, 1 % раствор перекиси водорода, нейтральный формалин, 0,1 н. раствор едкого натра, 5% раствор щавелевой кис­лоты, иммерсионное масло, фуксин, генцианвиолет, йодированный спирт, раствор Люголя, 2% сафронин, фильтровальная бумага, раствор для дезинфекции рук.

Изучение сопроводительных документов

При доставке животных на убой поставщик должен представить ве­теринарное свидетельство - форма № 1 или ветеринарную справ­ку - форма № 4 (при транспортировке в пределах района). Изучая этот документ, следует особое внимание обратить на эпизоотиче­ское состояние населенного пункта, из которого поступили живот­ные, на сроки проведения и результаты плановых диагностических исследований (на туберкулез, бруцеллез и др.) и вакцинаций. При направлении на вынужденный или диагностический убой больных животных в сопроводительном документе должен быть указан диа­гноз.

Отбор проб для проведения лабораторных исследований

Отбор проб для физико-химического исследования и микроскопии проводят после органолептического осмотра туши и органов. Отбира­ют три пробы мяса по 200 г каждая из передней, средней и задней ча­стей туши. Для приготовления мазков дополнительно можно отобрать лимфатические узлы и кусочки внутренних органов (печень, почка, селезенка, легкое).

Органолептические исследования

Степень обескровливания туши

Плохо обескровленное мясо имеет более темный цвет. Для определе­ния степени обескровливания мяса смотрят наполнение кровью кро­веносных сосудов, которые особенно хорошо видны на серозных обо­лочках. Кроме того, нужно посмотреть наличие крови на поверхности свежего разреза мяса, для определения влажности разреза используют полоску фильтровальной бумаги.

Существуют четыре степени обескровливания мяса: Хорошая - кровь в кровеносных сосудах отсутствует, поверхность разреза сухая, возможно небольшое количество мясного сока.

Удовлетворительная - обнаруживают небольшое количество крови в мелких кровеносных сосудах, в мышцах крови нет, поверхность раз­реза влажная.

Плохая - обнаруживают кровь в мелких и средних кровеносных сосудах, при надавливании на поверхности разреза выделяются капли крови.

Очень плохая - обнаруживают кровь в мелких, средних и крупных кровеносных сосудах, серозные оболочки фиолетово-красного цвета, на поверхности разреза выделяется кровь.

Мясо трупов имеет очень плохую степень обескровливания, мясо тяжелобольных животных, убитых в агональном состоянии - плохую или очень плохую.

Определение гипостазов

У трупов и плохо обескровленных туш кровь просачивается через стенки кровеносных сосудов и собирается в нижней части туши, образуя гипостазы - пропитанные кровью участки сине-красного цвета. Так как гипостазы образуются в нижней части туши, то верх­няя часть туши у трупа может быть обескровлена удовлетворитель­но. Поэтому по части туши или куску мяса нельзя судить об обе­скровливании всей туши.

Определение места зареза

Место зареза проверяют в том случае, если убой проводился от­крытым способом. Если животное на момент убоя было здорово, то место зареза будет неровным и пропитанным кровью. Это обуслов­лено тем, что мышцы после убоя умирают не сразу, отдельные мы­шечные волокна расслабляются, а другие сокращаются, кроме того, через место зареза происходит обескровливание. При имитации убоя у трупа место зареза ровное и не пропитано кровью. Поэтому частным лицам, поставляющим мясо на рынок запрещают зачищать место зареза.

Определение состояния лимфатических узлов

В тушах и органах, полученных от здоровых животных, лимфатиче­ские узлы желтого или серого цвета. У трупов и животных, убитых в агональном состоянии, вследствие плохого обескровливания и ги­поксии лимфатические узлы от розового до лилового цвета. У больных животных при развитии воспалительных процессов лимфатические узлы могут быть увеличены, при этом края разреза выворачиваются, а на поверхности разреза могут быть кровоизлияния и другие патоло­гические изменения.

Определение упитанности туш и органов

При определении упитанности животных особое внимание обра­щают на наличие признаков истощения. В отличие от исхудания, при истощении происходят дистрофические и дегенеративные из­менения в мышцах и жировой ткани. У истощенных животных кон­систенция жира становится студенистой. Наиболее удобно опреде­лять состояние жировой ткани между позвонками после разделения туши на полутуши.

Мясо истощенных животных направляют в техническую утили­зацию.

Определение патологоанатомических изменений в органах и тканях

Лабораторные исследования

при определении мяса больных животных

При определении мяса больных животных проводят следующие фи­зико-химические исследования: определение рН мяса, реакция на пе-роксидазу (бензидиновая проба), определение продуктов первичного распада белка (формольная проба и реакция с сернокислой медью), проба варки. Кроме того, проводят и микроскопию мазков отпечат­ков, окрашенных по Грамму и на капсулы В. anthracis.

До определения рН, постановки реакции на пероксидазу, а также формольной пробы и реакции с сернокислой медью мясо должно быть выдержано для созревания не менее 20-24 ч.

При исследовании мяса больных животных проводят микробио­логическое исследование мяса и внутренних органов для выявления возбудителя болезни и секундарной микрофлоры (Salmonella, Е. coli, Proteus и др.).

Микроскопия мазков-отпечатков

Техника приготовления мазка-отпечатка. Мазки готовят с верхнего и глу­бокого слоев каждой пробы. Из профламбированной пробы сте­рильными ножницами вырезают кусочек мяса размером не менее 1,5 х 2,0 х 2,5 см, поверхности срезов прикладывают к стерильному предметному стеклу (по три отпечатка на двух предметных стеклах). Мазки обводят с обратной стороны предметного стекла восковым карандашом, затем высушивают на воздухе, фиксируют над пла­менем газовой горелки и красят по Граму и на капсулы сибирской язвы по Ольту.

Окраска по Граму. На фиксированные мазки через полоску фильтро­вальной бумаги наливают карболовый генцианвиолет, через 2 мин краску сливают и мазок промывают водой, после чего на 2 мин наливают раствор Люголя, далее на 1 мин наливают йодированный спирт, в заключении ма­зок промывают водой и окрашивают фуксином в течение 2 мин. Затем мазок промывают и высушивают фильтровальной бумагой.

Окраска по Ольгу. Зафиксированные мазки окрашивают свежепри­готовленным подогретым 2% раствором сафранина в течение 1-2 мин (сибироязвенные бактерии окрашиваются в кирпично-красный цвет, а капсулы - в желтый).

Мазок микроскопируют при большом увеличении микроскопа (630-900 раз) под эмерсией. На одном предметном стекле исследуют 25 полей зрения.

В свежем мясе, полученном от здорового животного, микрофлоры быть не должно.

Физико-химические исследования

Проба варки

Постановка реакции. Готовят мясной бульон 1: 3. На лабораторных ве­сах (рис. 15) взвешивают 20-30 г мяса. Затем навеску мяса измель­чают ножницами до состояния фарша, помещают в коническую колбу на 100 мл. При помощи мерного цилиндра отмеряют 60-90 мл дистил­лированной воды и добавляют ее в колбу с мясом. Колбу закрывают часовым стеклом и ставят в кипящую водяную баню на 10 мин.

Учет реакции. Для учета реакции приподнимают стекло и определя­ют аромат паров бульона. После этого обращают внимание на прозрач­ность бульона: мясо здорового животного - бульон остается прозрач­ный, аромат специфический; мясо больного или убитого в агональном состоянии животного - отмечается помутнение бульона, аромат ослаб­лен, возможны посторонние запахи (лекарственные и др.); мясо тру­па - бульон мутный с хлопьями, запах затхлый или гнилостный.

Определение продуктов первичного распада белка в мясе

Реакция с сернокислой медью. Сущность методики заключается в том, что продукты первичного распада белка содержащиеся в фильтрате бу­льона, и сернокислая медь образуют комплексные соединения, кото­рые выпадают в осадок.

Постановка реакции. Готовят мясной бульон 1: 3, для этого в кони­ческую колбу помещают 20 г фарша, добавляют 60 мл дистиллирован­ной воды и тщательно перемешивают. Колбу накрывают крышкой и нагревают в течение 10 мин в кипящей водяной бане. Затем горячий бульон фильтруют через плотный слой ваты толщиной не менее 0,5 см в пробирку, помещенную в стакан с холодной водой. Если в фильтрате имеются хлопья, то его снова фильтруют через бумажный фильтр.

После фильтрации 2 мл профильтрованного бульона наливают в про­бирку и добавляют 3 капли 5 % раствора сернокислой меди, встряхива­ют 2-3 раза и выдерживают 5 мин.

Учет реакции: мясо здорового животного - бульон остается про­зрачный; мясо больного ими убитого в агональном состоянии животного

Отмечается помутнение бульона, а в бульоне из замороженного мяса

Интенсивное помутнение с образованием хлопьев; мясо трупа - в буль­оне образуются хлопья, выпадающие в желеобразный осадок.

Формольная проба (используется только при исследовании говяди­ны). Сущность методики заключается в осаждении продуктов первич­ного распада белка формальдегидом.

Постановка реакции. Готовят вытяжку 1:1. Для этого берут навеску 10 г мышечной ткани без жира и соединительной ткани и помещают в ступку, где при помощи ножниц измельчают ее до состояния фарша, затем туда добавляют 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 10 капель 0,1 н. раствора едкого натрия. Содержимое ступки тщательно перети­рают пестиком до мазеобразной консистенции и переносят в колбу. Колбу нагревают на электрической плитке, помешивая стеклянной палочкой для осаждения белков (до серого цвета). Колбу охлаждают холодной водопроводной водой. Содержимое колбы нейтрализуют 5 каплями 5 % раствора щавелевой кислоты и фильтруют через бумаж­ный фильтр. В пробирку отбирают 2 мл полученного фильтрата мяс­ной вытяжки и добавляют 1 мл нейтрального формалина.

Учет реакции: мясо здорового животного - мясной экстракт остает­ся прозрачным; мясо больного или убитого в агональном состоянии жи­вотного - мясной экстракт мутнеет, выпадает хлопьевидный осадок; мясо трупа - в мясном экстракте образуется желеобразный сгусток.

Реакция на пероксидазу (бензидиновая проба)

Пероксидаза - фермент, содержащийся в тканях животного и разруша­ющий перекисные соединения, образующиеся в процессе метаболизма. Сущность реакции заключается в том, что пероксидаза разлагает пере­кись водорода, и образующийся при этом атомарный кислород быстро окисляет бензидин до парахинодиимида, который с остатками бензидина образует соединение сине-зеленого цвета, переходящего в бурый.

Постановка реакции. Готовят мясной экстракт 1:4. В колбу поме­щают навеску 10-20 г мяса, измельченного ножницами до состояния фарша, добавляют 40-80 мл дистиллированной воды и экстрагиру­ют в течение 15 мин, перемешивая содержимое колбы стеклянной па­лочкой или используя магнитную мешалку (рис. 16), после чего филь­труют через бумажный фильтр.

Рис. 16. Магнитные мешалки

В пробирку вносят 2 мл профильтрованного мясного экстракта, до­бавляют 5 капель 0,2% спиртового раствора бензидина, содержимое пробирки взбалтывают, после чего добавляют две капли свежеприго­товленного 1 % раствора перекиси водорода.

Учет реакции: мясо здорового животного - вытяжка приобретает сине-зеленый цвет, переходящий в течение 1-2 мин в буро-коричне­вый (положительная реакция); мясо больного или убитого в агональном состоянии животного - вытяжка приобретает сине-зеленый цвет, переходящий в течение нескольких секунд в буро-коричневый (сом­нительная реакция); мясо трупа - вытяжка либо не приобретает спе­цифического сине-зеленого цвета, либо сразу проявляется буро-корич­невый цвет (отрицательная реакция).

Определение рН мяса

рН мяса определяют потенциометрическим и колориметрическим спо­собами.

Потенциометрический способ. Определение рН мяса проводят при по­мощи аналогового или цифрового потенциометра (рН-метра) непосредс­твенно в мясе специальным электродом-ножом (рис. 17) или в водной вытяжке, приготовленной в соотношении 1:10. Экстракт настаивают в течение 15 мин при периодическом перемешивании и фильтруют через бумажный фильтр. Определение рН проводят согласно инструкции (пас­порта) по эксплуатации потенциометра (рН-метра). В процессе работы периодически следует контролировать правильность показания прибора при помощи стандартных буферных растворов.

Колориметрический способ при помощи компаратора Михаэлиса.

Постановка реакции. Готовят мясной экстракт 1: 4. В колбу помещают навеску 20 г мяса, измельченного ножницами до состояния фарша, до­бавляют 80 мл дистиллированной воды и энергично перемешивают в течение 15 мин, после чего фильтруют через бумажный фильтр.

Рис. 18. Компаратор Михаэлиса

рН определяют при помощи цветных стандартов, запаянных в про­бирки, и компаратора с шестью гнездами (рис. 18), расположен­ными в 2 ряда по 3 в каждом. В гнезда компаратора вставляют про­бирки и заполняют их следующим образом: в пробирки первого ряда вносят по 2 мл мясного экстракта, далее в крайние пробирки вносят по 5 мл дистиллированной воды, а в центральную - 4 мл дистилли­рованной воды и 1 мл индикатора (0,1 % раствора паранитрофенола). В центральную пробирку второго ряда вносят 7 мл дистиллированной воды, а в крайние гнезда вставляют стандарты, подбирая их таким об­разом, чтобы при наблюдении через горизонтальные отверстия их цвет совпадал с цветом содержимого средней пробирки. рН мяса будет со­ответствовать цифре, указанной на этикетке стандарта.

Учет реакции: рН мяса здорового животного - 5,6-6,2; рН мяса больного животного - 6,3; рН мяса трупа смещается в щелочную сторо­ну - выше 6,4 и может достигать 7 и выше.

Ветеринарно-санитарная оценка мяса больных животных и трупов

Мясо считается полученным от здорового животного при наличии хо­роших органолептических показателей туши, отсутствии в мазках па­тогенных микробов, величине рН в пределах 5,6-6,2, положительной реакции на пероксидазу и отрицательных показателях формольной пробы и реакции с сернокислой медью.

Мясо больных, а также переутомленных животных имеет недоста­точное обескровливание, рН в пределах 6,3-6,5, сомнительную реак­цию на пероксидазу и при постановке формольной пробы и реак­ции с сернокислой медью в вытяжке образуются хлопья.

Мясо животных, убитых в состоянии агонии, имеет плохое обе­скровливание, сиреневато-розовую или синюшную окраску лимфати­ческих узлов, рН 6,6 и выше, отрицательную реакцию на пероксидазу, а формольная проба и реакция с сернокислой медью сопровождается образованием желеобразного сгустка.

Мясо и продукты убоя, полученные от трупов и животных, убитых в агональном состоянии, направляют на техническую утилизацию.

Вопрос об использовании мяса и продуктов убоя, полученных от боль­ных животных, решают после установления диагноза в соответствии с Правилами предубойного осмотра и послеубойной ветсанэксперти-зы мяса и мясных продуктов (от 1988 г.) и другими действующими нор­мативными документами.

Мясо здоровых животных используют без ограничений.

Сущность реакции заключается в том, что находящийся в мясе фермент пероксидаза разлагает перекись водорода с образованием кислорода, который и окисляет бензидин. При этом образуется парахинондиимид, который с недоокисленным бензидином дает соединение (парахинондиимид) сине-зеленого цвета, переходящего в бурый.

В ходе этой реакции важное значение имеет активность пероксидазы. В мясе здоровых животных она весьма активна, в мясе больных и убитых в агональном состоянии активность ее значительно снижается.

Пероксидаза + бензидин + 2H 2 O 2 + бензидин

парахинондиимид (сине-зеленый цвет, переходящий в буро-коричневый).

Техника определения. В пробирку наливают 2 мл мясной вытяжки в соотношении 1:4 (приготовленная для определения рН колориметрическим способом), приливают 5 капель 0,2%-ного раствора бензидина, взбалтывают и добавляют 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода.

Оценка результатов. При положительной реакции мясная вытяжка через 0,5 - 1,5 минуты приобретает сине-зеленый цвет, который быстро переходит в буро-коричневый. Такая реакция свойственна мясу, полученному от здорового животного.

Слабо положительная реакция (сомнительная). Вытяжка из мяса переутомленных, старых и заболевших животных приобретает сине-зеленый цвет, который с задержкой переходит в буро-коричневый.

Отрицательная реакция. В вытяжке из мяса тяжело больных или убитых в агональном состоянии животных сине-зеленый цвет не появляется, и вытяжка сразу приобретает буро-коричневый оттенок.

6.5 Формольная реакция (по г.В. Колоболотскому и е.В. Киселеву)

При тяжело протекающих заболеваниях, еще при жизни животного, в мышцах в значительном количестве накапливаются промежуточные и конечные продукты белкового обмена – полипептиды, пептиды, аминокислоты и др. Сущность данной реакции заключается в осаждении этих продуктов обмена формальдегидом.

Техника определения. Для постановки реакции необходима водная вытяжка из исследуемого мяса в соотношении 1:1. Для приготовления вытяжки 1:1 пробу мяса освобождают от жира и соединительной ткани и отвешивают 10 г. Затем навеску помещают в ступку, тщательно измельчают изогнутыми ножницами, приливают 10 мл физиологического раствора и 10 капель 0,1 Н раствора едкого натра.

Мясо растирают пестиком. Полученную кашицу переносят с помощью стеклянной палочки в колбу и нагревают до кипения для осаждения белков. Колбу охлаждают холодной водой под краном, после чего, ее содержимое нейтрализуют добавлением пяти капель 5%-ного раствора щавелевой кислоты и пропускают в пробирку через фильтровальную бумагу. Если вытяжка после фильтрации остается мутной, фильтруют вторично или центрифугируют.

Выпускаемый промышленностью формалин имеет кислую среду, поэтому его предварительно нейтрализуют 0,1 Н едким натром по индикатору, состоящему из равной смеси 0,2%-ных водных растворов нейтральрота и метиленового голубого до перехода цвета из фиолетового в зеленый.

Для реакции в пробирку наливают 2 мл вытяжки и добавляют 1 мл нейтрального формалина.

Оценка результатов. Положительная реакция. Вытяжка, полученная из мяса животного, убитого в агонии, тяжело больного или разделанного после падежа, превращается в плотный сгусток.

Сомнительная реакция. В вытяжке из мяса утомленного или заболевшего животного выпадают хлопья.

Отрицательная реакция. Вытяжка из мяса здорового животного остается прозрачной или слабо мутнеет.

Мясо считается полученным от здорового животного при наличии хороших органолептических показателей туши, отсутствии патогенных микробов, рН 5,7 - 6,2, положительной реакции на пероксидазу и отрицательной формольной реакции. Мясо больного, а также переутомленного животного недостаточно обескровлено, рН 6,3 - 6,5 реакция на пероксидазу отрицательная, а формольная проба - положительная (хлопья). Мясо животного, убитого в состоянии агонии, плохо обескровлено, с синюшной или сиреневато-розовой окраской лимфатических узлов, рН 6,6 и выше, реакция на пероксидазу отрицательная, а формольная реакция сопровождается образованием желеобразного сгустка.

Таблица 2 Лабораторные показатели мяса здоровых и больных животных

Показатели	Мясо здоровых животных	Мясо утомленного и заболевшего животного	Мясо тяжело больного животного или убитого в агональном состоянии
1.Бактериоскопия мазков-отпечатков	Микрофлора отсутствует	Единичные кокки или бактерии	Имеются кокки, палочки
2. рН мясной вытяжки			6,6 и выше
3. Реакция на пероксидазу	Положительная (сине-зеленое окрашивание, быстро переходящее в буро-коричневое)	Сомнительная или слабо положительная (сине-зеленое окрашивание с задержкой, переходящее в буро-коричневое)	Отрицательная (сине-зеленый цвет не появляется, а вытяжка сразу приобретает буро-коричневый цвет)
4. Формольная проба (для мяса крупного рогатого скота)	Отрицательная (вытяжка остается прозрачной или слабо мутнеет)	Сомнительная (выпадают хлопья)	Положительная (образуется плотный сгусток)

В присутствии перекиси водорода и пероксидазы бензидин образует более сложное соединение из двух молекул, окрашенное в синий цвет. Оно постепенно разлагается с образованием бурого вещества.

Недостатком бензидиновой реакции является ее диффузность. Для ее устранения к реактиву добавляют молибденовокислый аммоний, который осаждает окрашенное вещество.

Реактивы

1) 0,85%-ный раствор поваренной соли.

2) 0,1%-ный раствор молибденовокислого аммония на солевом растворе.

3) Насыщенный раствор бензидина в солевом растворе.

4) 20%-ный раствор перекиси водорода.

5) Смесь перекиси водорода с бензидином из расчета 1 капля перекиси водорода на 2 мл бензидина (смешать перед употреблением).

Проведение реакции

1. Поместить срезы в 0,85%-ный раствор поваренной соли при 4° С в часовом стекле на 3 мин.

2. Обработать срезы раствором 0,1%-ного молибденовокислого аммония в солевом растворе в течение 5 мин.

3. Обработать срезы раствором бензидина, смешанного перед употреблением с перекисью водорода, в течение 5 мин (до появления синей окраски).

4. Промыть срезы свежим охлажденным солевым раствором.

5. Наблюдать локализацию синей окраски.

Результаты реакции (табл. 28, 29)

В листе капусты в местах скопления активной пероксидазы выпадают синие кристаллы. Реакция идет во всех тканях листа с заметной интенсивностью, причем более или менее равномерно во всей паренхиме. В пучках особенно интенсивно красится флоэмная часть. Камбий окрашивается значительно слабее. Обилие пероксидазы во флоэме, по-видимому, объясняется тем, что пластические вещества, передвигающиеся по клеткам, подвергаются частичному окислению и расходуются на синтез веществ новых клеток, образуемых камбием.

В зерновке кукурузы реакция протекает с незначительной интенсивностью. В зародыше окраска почти такая же слабая, как и в эндосперме. Более интенсивная окраска характеризует проводящие элементы. Окраска цитоплазмы клеток, дающих реакцию, неравномерна, пластиды окрашиваются значительно сильнее, чем цитоплазма.

Метод основан на способности фермента пероксидазы принимать участие в процессах окисления за счет кислорода пероксида водорода. Присутствие пероксидазы устанавливают, используя реакции с гваяколом, бензидином, амидопирином (пирамидоном). При температуре 80 °C пероксидаза инактивируется. Следовательно, если в исследуемом изделии пероксидаза обнаруживается, тепловая обработка считается недостаточной.

Аппаратура, материалы, реактивы . Весы лабораторные; пробирки химические диаметром 15 мм; пробки корковые; штатив для пробирок; ступка фарфоровая диаметром 7 - 9 см; капельницы; часы песочные на 1, 2 мин.; воронки стеклянные диаметром 4 - 5 см; пипетки вместимостью 1 и 20 см 3 ; колбы конические вместимостью 50 и 100 см 3 ; бумага фильтровальная; вата; гваякол, спиртовой раствор с массовой долей 1% (1 г гваякола растворяют этиловым спиртом в мерной колбе на 100 см 3); бензидин, спиртовой раствор с массовой долей 0,02% (20 мг бензидина растворяют в 100 см 3 этилового спирта); амидопирин, спиртовой раствор с массовой долей 2% (2 г амидопирина растворяют в 98 см 3 этилового спирта); спирт этиловый; пероксид водорода (30 - 35%), раствор с массовой долей 10%; кислота уксусная ледяная; ацетат натрия безводный; вода дистиллированная.

Проведение испытания . Окислительно-восстановительные свойства пероксидазы проявляются в строго определенном интервале pH. Наиболее интенсивная окраска наблюдается в интервале значений pH от 4,4 до 6,9; менее интенсивная при pH 3,4 и выше; не проявляется при pH выше 10,4.

При анализе используют ацетатный буферный раствор с pH 4,9.

Измельченную навеску, взятую из внутренней части жареного изделия в количестве 10 г и взвешенную с точностью до 0,01 г, растирают в ступке с 20 см 3 дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр или слой ваты в коническую колбу. Затем отбирают в пробирку 0,5 см 3 фильтрата, добавляют 0,5 см 3 ацетатного буфера, 0,5 см 3 спиртового раствора гваякола, 0,25 см 3 свежеприготовленного раствора пероксида водорода и встряхивают. При достаточной термической обработке мясного изделия раствор остается бесцветным, при недостаточной, в зависимости от количества сохраненной пероксидазы, окраска может быть от светло-голубой до темно-синей и проявляется в течение 1 мин.

При использовании спиртового раствора бензидина или спиртового раствора амидопирина в пробирку отбирают 1 см 3 фильтрата, добавляют 1 см 3 одного из указанных растворов, а также 0,5 см 3 раствора пероксида водорода и встряхивают. При наличии пероксидазы в течение 1 мин. появляется соответственно сине-зеленое или сине-фиолетовое окрашивание. При достаточной тепловой обработке изменения цвета не происходит.

Учитывая, что в мясе больных животных и в несвежем мясе происходит инактивация фермента пероксидазы, для окончательного суждения о качестве тепловой обработки кулинарных изделий необходимо проверить наличие пероксидазы в мясном полуфабрикате. При отсутствии пероксидазы в полуфабрикате достаточность тепловой обработки определяют пробой на фосфатазу.

Проба на фосфатазу

Качественная реакция. Метод основан на способности фермента фосфатазы расщеплять бариевую соль паранитрофенилфосфата при температуре 38 °C, освобождая паранитрофенол, который окрашивает среду в желтый цвет.

Весы лабораторные; плитка электрическая; баня водяная; ступка фарфоровая диаметром 7-9 см; цилиндр вместимостью 1 см 3 ; воронка делительная вместимостью 250 см 3 ; пробки корковые; капельница; воронки стеклянные диаметром 4-5 см; марля; бумага фильтровальная; вата стеклянная; бариевая соль паранитрофосфата, насыщенный раствор; гидроксид натрия, раствор массовой концентрации 400 г/дм 3 (Д = 1,43 г/куб. см); хлорид магния, раствор массовой концентрации 5 г/ дм 3 ; ацетатный буфер pH 5,4; вода дистиллированная.

Проведение испытания. Измельченную навеску, взятую из внутренней части изделия в количестве 20 г и взвешенную с точностью до 0,01 г, переносят в ступку и растирают, добавляя постепенно 50 см 3 дистиллированной воды. Полученную взвесь процеживают через двойной слой марли, а оставшуюся в марле навеску отжимают, затем вытяжку фильтруют через сухой складчатый фильтр и делят пополам. Одну часть (фильтрат 1) исследуют непосредственно, другую (фильтрат 2) переносят в коническую колбу, доводят до кипения и снова фильтруют - эта часть фильтрата является контрольной.

Для проверки активности фосфатазы в пробирку отмеривают 1 см 3 фильтрата 1, прибавляют 2 капли раствора хлорида магния массовой концентрации 5 г/дм 3 , 2 капли ацетатного буфера (pH 5,4) и 0,5 см 3 раствора бариевой соли паранитрофенилфосфата.

Для контроля во вторую пробирку отмеривают 1 см 3 фильтрата 2 и добавляют те же реактивы, что и в первую. Обе пробирки помещают на 1 ч в водяную баню или термостат при температуре 37-38 °C. Затем в обе пробирки добавляют по капле раствора гидроксида натра.

При достаточной тепловой обработке кулинарного изделия окраска в обеих пробирках не меняется. При недостаточной тепловой обработке раствор желтеет.

Определение остаточной активности кислой фосфатазы (количественное определение). Метод основан на фотометрическом определении в продукте интенсивности развивающейся окраски, зависящей от остаточной активности кислой фосфатазы, выраженной массовой долей фенола.

Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; потенциометр с погрешностью измерения ± 0,06 pH; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр для измерения в видимой области спектра; ультратермостат или водяная баня; воронки; колбы мерные вместимостью 500 и 1000 см 3 ; пипетки градуированные на 1; 5; 10 см 3 ; палочки стеклянные; пробирки; бумага фильтровальная; груша резиновая; кислота лимонная; цитрат натрия 5-водный; динатриевая соль фенилфосфорной кислоты, раствор массовой концентрации 2 г/дм 3 , свежеприготовленный; кислота трихлоруксусная, кристаллическая, растворы массовой концентрации 50 и 200 г/дм 3 ; гидроксид натрия, раствор C(NaOH) = 0,5 моль/дм 3 ; вода дистиллированная; фенол; толуол; вольфрамат натрия; сульфат лития 1-водный; кислота ортофосфорная плотностью 1,72 г/см 3 ; кислота соляная плотностью 1,19 г/см 3 ; бром.

Подготовка к испытанию. Ацетатный буфер : в мерной колбе вместимостью 1000 см 3 в дистиллированной воде растворяют 13,88 г цитрата натрия и 0,588 г лимонной кислоты, доливают водой до метки и перемешивают, pH буфера 6,5. Затем добавляют 1 см 3 толуола. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 ±1°C не более 12 сут.

Реактив Фолина: 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия растворяют в 700 см 3 дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 см 3 ортофосфорной кислоты и 100 см 3 соляной кислоты. Смесь осторожно кипятят в течение 10 ч в колбе вместимостью 2000 см 3 с обратным холодильником, после чего охлаждают и добавляют 150 г сульфата лития, 50 см 3 воды и несколько капель брома. Остаток брома отгоняют кипячением смеси без холодильника в вытяжном шкафу, охлаждают, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 , доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют. Реактив должен быть золотисто-желтого цвета без зеленого оттенка; его хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте не более 6 мес.

Стандартный раствор : 2 г фенола (взвешивают с точностью до 0,001 г) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1000 см 3 , доводят объем до метки и перемешивают. Отбирают пипеткой с помощью резиновой груши 5 см 3 раствора в колбу вместимостью 500 см 3 , добавляют около 300 см 3 дистиллированной воды, вносят 25 г кристаллической трихлоруксусной кислоты. После растворения содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Полученный раствор содержит 20 мкг фенола в 1 см 3 .

Построение градуировочного графика . В пробирки вносят следующие объемы стандартного раствора: 0; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 см 3 , что соответствует массе фенола: 0; 5; 10; 20; 30; 40 мкг. Доводят объем каждой пробирки до 2,5 см 3 , добавляя соответствующий объем раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/дм 3 (2,5; 2,25; 2,0; 1,5; 1,0; 0,5 см 3), и перемешивают. В каждую пробирку добавляют 5 см 3 раствора гидроксида натрия, перемешивают, выдерживают 10 мин., добавляют 1,5 см 3 реактива Фолина, разведенного дистиллированной водой в соотношении 1:2, и перемешивают.

Через 30 мин. измеряют оптическую плотность растворов по отношению к раствору трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/дм 3 на фотоэлектроколориметре с применением светофильтра с длиной волны 600 ± 10 нм в кювете с расстоянием между рабочими гранями 10 мм или спектрофотометра при длине волны 600 нм в кювете аналогичного размера.

По полученным средним данным по трем стандартным растворам на миллиметровой бумаге размером 20x20 см строят градуировочный график. На оси абсцисс откладывают значение массовой доли фенола (микрограмм в 9 см 3 окрашенного раствора); на оси ординат - значение соответствующей оптической плотности (Д). Градуировочный график должен проходить через начало координат.

Проведение испытания. От объединенной пробы, подготовленной к испытанию, берут 2 навески массой по 1 г (с точностью до 0,001 г) и переносят в две пробирки (контрольную и опытную).

В пробирки вносят по 10 см 3 ацетатного буфера pH 6,5, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и настаивают в течение 20 мин. при температуре 20 °C, периодически перемешивая.

В контрольную пробирку добавляют 5 см 3 (200 г/дм 3) раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и добавляют 5 см 3 (2 г/дм 3) раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты, выдерживают 10 мин и фильтруют.

В опытную пробирку добавляют 5 см 3 (2 г/дм 3) раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты и помещают в термостат при температуре 39 ± 1 °C на 1 ч, затем добавляют 5 см 3 200 г/дм 3 раствора трихлоруксусной кислоты, выдерживают 10 мин. и фильтруют.

Для проведения цветной реакции из контрольной и опытной пробирок отбирают по 2,5 см 3 безбелкового фильтрата. Цветную реакцию проводят по методу, описанному выше.

Массу фенола в навеске определяют по градуировочному графику.

Обработка результатов. Массовую долю фенола (X, %) вычисляют по формуле:

m 1 - масса фенола в опытной пробирке, найденная по

градуировочному графику, мкг;

m 2 - масса фенола в контрольной пробирке, найденная по

градуировочному графику, мкг;

m - масса анализируемой пробы, г;

10 - коэффициент пересчета;

20 - разведение;

2,5 - объем фильтрата, отобранный для цветной реакции,

Вычисление проводят до 0,0001.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допустимое расхождение между которыми при P = 0,95 не должно превышать 10% по отношению к среднему арифметическому.

Окончательный результат определяют до 0,001.

Анализ результатов работы: сделать выводы о влиянии сульфитации на активность окислительно-восстановительных процессов, сравнить активность каталазы в разных образцах.

Контрольные вопросы

1. Что такое ферменты?

2. Какими свойствами обладают ферменты?

3. Какие факторы влияют на активность ферментов?

4. Какой принцип положен в основу классификации ферментов? Сколько классов ферментов включает их классификация?

5. Какова роль окислительно-восстановительных ферментов?

6. Каковы строение и механизм действия дегидрогеназ?

7. Каковы строение и механизм действия полифенолоксидазы?

8. Каковы строение и механизм действия аскорбатоксидазы?

9. Каковы строение и механизм действия липоксигеназы?

10. Каковы строение и механизм действия пероксидазы?

11. Каковы строение и механизм действия каталазы?

12. Какова роль каталазы в пищевых технологиях и в процессах жизнедеятельности клетки?

13. Как определить активность каталазы?

Задания к теме

1. Каким свойством обладают ферменты?

а) Специфичность действия.

б) Способность сдвигать равновесие в системе.

в) Термостабильность.

г) Универсальность действия.

2. Какая из аминокислот наиболее часто входит в активный центр фермента?

а)Серин, б)Глицин, в)Валин, г)Метионин.

3. Для чего служит каталитический центр фермента?

а) Присоединение кофермента.

б) Превращение субстрата.

в) Связывание эффекторов.

4. Какой класс ферментов ускоряет реакции распада с участием воды?

а) Оксидоредуктазы, б) Трансферазы, в) Гидролазы, г) Лиазы.

5. Какие реакции ускоряют ферменты класса лигаз?

а) Негидролитический распад органических молекул.

в) Реакции синтеза.

6. Что такое кофермент?

б) Небелковое, легко отделяющееся от фермента вещество, участвующее в катализе.

в) Неактивный предшественник фермента.

г) Активатор фермента.

7. Для чего служит контактный участок?

а) Присоединение кофермента.

б) Превращение субстрата.

в) Связывание эффекторов.

г) Присоединение и ориентация субстрата.

8. Что такое изоэнзимы?

а) Ферменты, катализирующие реакции изомеризации.

б) Денатурированные энзимы.

в) Ферменты, имеющие разную четвертичную структуру, но катализирующие одну и ту же реакцию.

г) Энзимы, имеющие одинаковую брутто-формулу, но разное строение.

9. Какие реакции ускоряют ферменты класса лиаз?

а) Негидролитический распад и синтез с образованием двойных связей.

б) Реакции переноса функциональных групп.

в) Реакции изомеризации.

г) Окислительно-восстановительные реакции.

10. Что такое простетическая группа?

а) Фермент, связанный с субстратом.

б) Небелковая часть молекулы фермента, легко отделяющаяся от него.

в) Небелковая часть молекулы, прочно связанная с апоферментом.

г) Фрагмент одного из витаминов.

Проверь себя

1. Совокупность каталитического и субстратного центров фермента называется:

а) апофермент, б) активный центр фермента, в) аллостерически участок.

2. Небелковая часть сложного фермента, ответственная за катализ называется:

а) кофермент, б) кофактор, в) апофермет.

3. Клеточные ферменты, локализованные в цитоплазме, проявляют максимальную активность при рН, близком к:

а) 7, б) 2-3, в) 4-5, г) 9-10.

4. В состав кофермента входит витамин:

а) А, б) В 6 , в) В 2 , г) К.

5. Ферменты, катализирующие синтез биологических молекул с участием АТФ относятся к классу:

а) трансфераз, б) лигаз, в) гидролаз, г) лиаз, д) изомераз.

Помогите найти фото или картинку где будет показано взаимодействие перекиси водорода с картофелем или мясом. и получил лучший ответ

Ответ от Елена Казакова[гуру]

С помощью опыта выяснить наличие в клубнях картофеля ферментов,
расщепляющих перекись водорода
Оборудование, реактивы. Штатив лабораторный с пробирками, пипетки с метками на 1 мл; кусочки сырого и вареного картофеля (или сырого и вареного мяса) ; пероксид водорода (3%-ый раствор или 0,5%-ый раствор) ; лучинка; спички.
Ход работы. В одну пробирку помещают ломтики сырого картофеля, в другую – вареного (в третью и четвертую пробирки можно положить кусочки сырого и вареного мяса, соответственно) . В каждую пробирку с помощью пипетки приливают 0,5 мл 3%-ного раствора пероксида водорода (Н2О2).
При выделении пузырьков опустить в каждую из этих пробирок тлеющую лучинку.
Наблюдения.
В пробирках с сырым картофелем (или мясом) будет наблюдаться бурное образование пузырьков («вскипание») . Тлеющая лучинка, помещенная в пробирку, вспыхивает.
В пробирках с вареным картофелем и вареным мясом пероксид водорода не расщеплается, пузырьки не выделяются.
Обсуждение результатов. Образование пузырьков в пробирках с сырым картофелем или мясом объясняется присутствием в клетках фермента пероксидазы – у растений (или каталазы – в мышцах) , которые расщепляют перекись водорода до воды и кислорода. Молекулярный кислород выделяется в виде пузырьков. Наличие кислорода можно определить с помощью тлеющей лучинки, которая вспыхивает, если ее внести в пробирку с выделяющимися пузырьками.
В пробирках с вареным картофелем и вареным мясом пероксид водорода не расщепляется, т. к. при варке ферменты (вещества белковой природы) денатурируют – происходит нарушение третичной структуры фермента и утрата его каталитической активности.
Токсичный (ядовитый) пероксид водорода образуется в некоторых растительных и животных клетках в качестве побочного продукта метаболизма (при биологичесом окислении) . Это соединение токсично для клеток и пероксидаза (или каталаза) , содержащиеся в пероксисомах, обеспечивают эффективное его удаление. Под действием ферментов каталазы (мышц, крови) или пероксидазы (картофеля, элодеи) пероксид водорода тотчас расщеплается до молекулярного кислорода и воды, согласно уравнению:
Каталаза (пероксидаза)
2Н2О2 = 2Н2О + О2
Каталаза – один из наиболее быстроработающих ферментов. При 0 градусах С одна молекула каталазы разлагает в 1 с до 40000 молекул пероксида водорода. Одна молекула фермента за 1 минуту расщепляет до 5 миллионов молекул пероксида водорода, защищая клетку от отравления. Локализуется каталаза в микротельцах и пероксисомах. Пероксидаза и каталаза относятся к классу оксидоредуктаз, т. к. реакция расщепления перикиси водорода является окислительно-восстановительной.
Аналогично, если капнуть пероксид водорода на лист элодеи, то будет наблюдаться бурное выделение пузырьков газа – кислорода.
Наиболее сильнодействующая пероксидаза содержится в хрене. Ее специально получают для молекулярно-генетических исследований.
Выводы. В живых клетках содержатся ферменты – вещества белковой природы, ускоряющие ход биохимических реакций за счет снижения энергии активации. В этом опыте можно оп-ределить наличие в сырых продуктах фермента каталазы – в клетках животных (или пероксидазы – в клетках растений) . При термической денатурации происходит необратимая денатурация фермента (разрушение его третичной структуры и утрата каталитической активности) . Утрата каталитической активности каталазы (пероксидазы) после кипячения продуктов подтверждает белковую природу ферментов.