Серологические методы диагностики вирусных инфекций. Торможение гемагглютинации. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Прямая иммунофлюоресценция. Иммуноэлектронная микроскопия.
При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики . Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.
РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.
Торможение гемагглютинации
РТГА применяют для идентификации вирусов , способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.
Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов
Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым AT.
Прямая иммунофлюоресценция
Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклона л ьных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать несвязавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).
Иммуноэлектронная микроскопия
Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.
2. Серологические реакции, используемые для диагностики вирусных инфекций.
Серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген-антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др. При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов. Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН среды). Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Прочность и количество связавшегося антигена антителами зависят от аффинности, авидности антител и их валентности.
3. Возбудители малярии. Малярия – антропонозная инфекционная болезнь, вызываемая несколькими видами простейших рода Plasmodium, передающаяся комарами (Anopheles), сопровождающаяся лихорадкой, анемией, увеличением печени и селезенки. Возбудители малярии относятся к Protozoa, типу Apicomplexa, классу Sporozoa и видам Pl. vivax, Pl.malariae, Pl.falciparum, Pl.ovale.
Эпидемиология. Источник инфекции – инвазированный человек; переносчик – самка комара рода Anopheles. Основной механизм передачи – трансмиссивный, через укус инвазированной самки комара.
Лечение и профилактика. Противомалярийные препараты оказывают различное действие на бесполые, половые стадии плазмодиев. К основным противомалярийным препаратам относят хинин, хлорохин, акрихин, примахин, хиноцид, бигумаль, хлоридин и др. Профилактические мероприятия направлены на источник возбудителя (лечение больных малярией и носителей) и уничтожение переносчиков возбудителя – комаров. Разрабатываются методы вакцинации на основе антигенов, полученных методом генетической инженерии.
1.Классификация антибиотиков по химической структуре, механизму, спектру и типу действия. По хим. структ. 1класс- В-лактам – пенициллин, цефалоспорин. 2 класс- макролиды- эритромицин, азитромицин. 3 класс- аминогликозиды- стрептомицин, канамицин. 4 класс-тетрациклины-окситетрациклин, доксициклин. 5 кл- полипептиды- полимиксин. 6 кл- полиен- нистатин 7кл- анзамицин- рифампицин.
2.В зависимости от механизма действия различают пять групп антибиотиков: 1.гр антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки- β-лактамы. 2.гр антибиотики, нарушающие молекулярную организацию и синтез клеточных мембран - полимиксины, полиены;3.гр антибиотики, нарушающие синтез белка -аминогликозиды, тетрациклины, макроли-ды, левомицетин.4.гр антибиотики - ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот - хинолоны нарушают синтез ДНК, рифампицин - синтез РНК;5.гр антибиотики, подавляющие синтез пуринов и аминокислот- сульфаниламиды.По спектру действия антибиотики пять групп в зависимости от того, на какие микроорганизмы они оказывают воздействие. Каждая из этих групп включает две подгруппы: антибиотики широкого и узкого спектра действия.1гр. Антибактериальные антибиотики составляют самую многочисленную группу препаратов.
а) антибиотики широкого спектра действия оказывают влияние на представителей всех трех отделов бактерий- аминогликозиды, тетрациклины и др.
б) Антибиотики узкого спектра действия эффективны в отношении небольшого круга бактерий- полет-миксины действуют на грациликутные, ванкомицин влияет на грамположительные бактерии.
2гр -противотуберкулезные, противолепрозные, противосифилитические препараты.
3.Противогрибковые антибиотики.
а) Широким спектром действия обладает амфотерицин В, эффективный при кандидозах, бластомикозах, аспергиллезах; в то же время
б) антибиотиком узкого спектра действия.- нистатин, действующий на грибы рода Candida, является
4.Антипротозойные и антивирусные антибиотики насчитывают небольшое число препаратов.
5.Противоопухолевые антибиотики - препараты, обладающими цитотоксическим действием. Большинство из них применяют при многих видах опухолей- митомицин С. Действие антибиотиков на микроорганизмы связано с их способностью подавлять те или иные биохимические реакции, происходящие в микробной клетке.
2. Теории иммунитета. 1.Теория иммунитета Мечникова – фагоцитоз играет решающую роль в антибактериальном иммунитете. И.И.Мечников первым рассматривал воспаление как защитное, а не разрушительное явление. Ученый назвал действующие таким образом защитные клетки "пожирающими клетками". Его молодые французские коллеги предложили использовать греческие корни того же значения. И.И.Мечников принял этот вариант, и появился термин "фагоцит". 2.Теория иммунитета Эрлиха - одна из первых теорий антителообразования, согласно которой у клеток имеются антигенспецифические рецепторы, высвобождающиеся в качестве антител под действием антигена. Противомикробные вещества крови Эрлих назвал "антитело". П.Эрлих осознал, что и до контакта с конкретным микробом в организме уже есть антитела в виде, который он назвал "боковыми цепями"- это рецепторы лимфоцитов для антигенов. Потом Эрлих "применил" к фармакологии: в своей теории химиотерапии он предполагал предсуществование в организме рецепторов для лекарственных веществ. В 1908 г. П.Эрлиху вручили Нобелевскую премию за гуморальную теорию иммунитета. 3.Теория иммунитета Безредки - теория, объясняющая защиту организма от ряда инфекционных болезней возникновением специфической местной невосприимчивости клеток к возбудителям. 4. Инструктивные теории иммунитета - общее название теорий антителообразования, согласно которым ведущая роль в иммунном ответе отводится антигену, прямо участвующему в качестве матрицы при формировании специфической конфигурации антидетерминанты либо выступающему в качестве фактора, направленно изменяющего биосинтез иммуноглобулинов плазматическими клетками.
3.Возбудитель ботулизма. род Clostridiumвид Clostridium botulinumвызывает ботулизм - пищевую интоксикацию, характеризующуюся поражением цнс. Болезнь возникает в результате употребления пищевых продуктов, содержащих токсины С. Botulinum - грамлоложительные палочки с закругленными концами. имеет форму теннисной ракетки. Не образуют капсулу. Подвижны. Облигатные анаэробы. По антигенным свойствам которых разделяются на 7 сероваров. Ботулинический экзотоксин - самый сильный из всех биологических ядов- оказывая нейротоксическое действие (смертельная доза для человека составляет около 0,3 мкг). Микробиологическая диагностика . Выявление и идентификация ботулинического токсина в исследуемом материале с помощью реакции обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА), реакции нейтрализации токсина антитоксином (антитоксической сывороткой) на лабораторных животных. Бактериологический метод цпя обнаружения возбудителя в исследуемом материале. Специфическая профилактика. Ботулинические анатоксины А, В, Е входят в состав секстанатоксина, применяемого по показаниям. Для экстренной пассивной профилактики возможно применение противоботулинических антитоксических сывороток Лечение. Используют антитоксические противоботулинические гетерологичные сыворотки и гомологичные иммуноглобулины.
Культивирование . На кровяном агаре образует небольшие прозрачные колонии, окруженные зоной гемолиза. Резистентность. Споры С. botulinum обладают очень высокий резистентностью к высоким температурам.
Эпидемиология. Из почвы ботулиническая палочка попадает в пищевые продукты, где размножается и выделяет экзотоксин. Путь передачи инфекции – пищевой. Чаще всего фактором передачи инфекции являются консервы (грибные, овощные, мясные, рыбные). От человека человеку заболевание не передается. Патогенез. Ботулинический токсин попадает с пищей в пищеварительный тракт. Устойчивый к действию пищеварительных ферментов, токсин всасывается через стенку кишечника в кровь и обусловливает длительную токсинемию. Токсин связывается нервными клетками и блокирует передачу импульсов через нервно-мышечные синапсы. В результате развивается паралич мышц гортани, глотки, дыхательных мышц, что приводит к нарушению глотания и дыхания, наблюдаются изменения со стороны органов зрения. Клиническая картина. Инкубационный период продолжается от 6-24 ч до 2-6 дней. Чем короче инкубационный период, тем тяжелее протекает болезнь. Обычно заболевание начинается остро, но температура тела при этом остается нормальной. Возможны различные варианты ботулизма – с преобладанием симптомов поражения пищеварительного тракта, расстройств зрения или дыхательной функции. В первом случае заболевание начинается с появления сухости во рту, тошноты, рвоты, поноса. Во втором – первые проявления болезни связаны с нарушениями зрения (больной жалуется на «туман» перед глазами и двоение). В результате паралича мышц гортани появляется осиплость, а затем голос пропадает. Больные могут погибнуть от паралича дыхания. Заболевание может осложниться острой пневмонией, токсическим миокардитом, сепсисом. Летальность при ботулизме составляет 15-30%. Иммунитет. не формируется. Антитела, которые вырабатываются в течение заболевания, направлены против определенного серовара.
1.Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. 1)Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). 2)Методы определения. минимального уровня антибиотика, который позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. А)Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.Б)Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. В)На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.
Г)Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий.
Д)Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов. 3)Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом - исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина - Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18-20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024- 0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.
4)Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лакта-мазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).
2.Расстройства иммунной системы: первичные и вторичные иммунодефициты. Иммунодефициты - это нарушения нормального иммунного статуса, обусловленные дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа.Первичные, или врожденные иммунодефициты.Расстройства иммунной системы могут затрагивать как основные специфические звенья в функционировании иммунной системы, так и факторы, определяющие неспецифическую резистентность. Возможны комбинированные и селективные варианты иммунных расстройств. В зависимости от уровня и характера нарушений различают гуморальные, клеточные и комбинированные иммунодефициты.
Причины : удвоение хромосом, точечные мутации, дефект ферментов обмена нуклеиновых кислот, генетически обусловленные нарушения мембран, повреждения генома в эмбриональном периоде и др. Первичные иммунодефицита проявляются на ранних этапах постнатального периода и наследуются по аутосомно-рецессивному типу. Проявления – недостаточность фагоцитоза, системы комплемента, гуморального иммунитета (В-системы), клеточного иммунитета (Т-системы). Вторичные, или приобретенные, иммунодефициты Вторичные иммунодефициты в отличие от первичных развиваются у лиц с нормально функционировавшей от рождения иммунной системой. Они формируются под воздействием окружающей среды на уровне фенотипа и обусловлены нарушением функции иммунной системы в результате различных заболеваний или неблагоприятных воздействий на организм. Поражаться Т- и В-системы иммунитета, факторы неспецифической резистентности, возможны также их сочетания. Вторичные иммунодефицита встречаются значительно чаще, чем первичные. Вторичные иммунодефициты поддаются иммунокоррекции,
Вторичные иммунодефицита могут быть:
после перенесенных инфекций (особенно вирусных) и инвазий (протозойные и гельминтозы);
при ожоговой болезни;
при уремии; при опухолях;
при нарушении обмена веществ и истощении;
при дисбиозах;
при тяжелых травмах, обширных хирургических операциях, особенно выполняемых под общим наркозом; при облучении, действии химических веществ;
при старении,
медикаментозные, связанные с приемом лекарств.
По клиническому течению выделяют: 1)компенсированную, - повышенной восприимчивостью организма к инфекционным агентам. 2)субкомпенсированную- хронизация инфекционных процессов.
3)декомпенсированную - генерализованных инфекций, вызванных условно-патогенными микробами (УПМ) и злокачественными новообразованиями.
3. Возбудитель амебиаза. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическое лечение. Амебиаз – инфекционная болезнь, вызываемая Entamoeba histolytica, сопровождающаяся язвенным поражением толстой кишки; возможно образование абсцессов в различных органах; протекает хронически. Protozoa, типу Sarcomastidophora, подтипу Sarcodina.
Морфология и культивирование. Возбудитель существует в двух стадиях развития: вегетативной и цистной. Вегетативная стадия имеет несколько форм (тканевая, большая вегетативная, просвет-ная и предцистная). Циста (покоящаяся стадия) имеет овальную форму, образуется из вегетативных форм в кишечнике. Инфицирование происходит при попадании цист возбудителя в кишечник, где из них образуются кишечные вегетативные формы.
Резистентность . Вне организма быстро (через 30 мин) погибают тканевая и просветная формы возбудителя. Цисты устойчивы в окружающей среде, сохраняясь в фекалиях и воде при температуре 20ºС в течение месяца. В продуктах питания, на овощах и фруктах цисты сохраняются в течение нескольких дней.
Механизм передачи – фекаль-но-оральный. Заражение происходит при занесении цист с продуктами питания, особенно овощами и фруктами, реже – с водой, через предметы домашнего обихода. Распространению цист способствуют мухи и тараканы.
Патогенез и клиническая картина. Цисты, попавшие в кишечник, и образовавшиеся просветнью формы амеб могут обитать в нем, не вызывая заболевания. При снижении резистентности организма амебы внедряются в стенку кишечника и размножаются. Развивается кишечный амебиаз. Этому процессу способствуют некоторые представители микрофлоры кишечника. Поражаются с образованием язв верхний отдел толстой кишки, иногда – прямая кишка. Отмечается частый жидкий стул. В испражнениях обнаруживают гнойные элементы и слизь. Может происходить перфорация кишечной стенки с развитием гнойного перитонита. Амебы с током крови могут попадать в печень, легкие, головной мозг – развивается внекишечный амебиаз. Возможно появление кожного амебиаза, развивающегося как результат вторичного процесса. На коже перианальной области, промежности и ягодиц образуются эрозии и малоболезненные язвы. Иммунитет. При амебиазе иммунитет нестойкий. Лечение и профилактика . В лечении используются следующие препараты: действующие на амеб, находящихся в просвете кишечника (производные оксихинолина – хиниофон, энтеросептол, мексаформ, интестопан, а также соединения мышьяка – аминарсон, осарсол и др.); действующие на тканевые формы амеб (препараты эметина); действующие на просветные формы амеб и амеб, находящихся в стенке кишки (тетрациклины); действующие на амеб при любой их локализации (производные имидазола – метронидазол). Профилактика амебиаза связана с выявлением и лечением цистовыделителей и носителей амеб.
Микробиологическая диагностика. Основной метод - микроскопическое исследование испражнений больного, а также содержимого абсцессов внутренних органов. Мазки окрашивают раствором Люголв или гематоксилином с целью идентификации цист и трофозоитов. Серологический метод: РИГА, ИФА, РСК и др. Наиболее высокий титр антител выявляют при внекишечном амебиазе.
| " |
Основан на определении в крови больного противовирусных антител в серологических реакциях с использованием специфических вирусных антигенов - диагностикумов или специальных тест-систем. Серологические реакции при вирусных инфекциях ставят в жидкой среде (РСК, РТГА, РНГА, РОНГА, РТОНГА, РИА), в геле (РПГ, РРГ, РВИЭФ) или на твердофазном носителе (например, на стенках лунки полистиролового планшета с фиксацией на них одного из компонентов иммунной реакции – антигена или антитела). Известны такие твердофазные методы как ИФА, ИЭМ, РГадсТО, РИФ, РГадс, РТГадс.
Нередко, вследствие наличия в крови большинства здоровых людей естественных противовирусных антител, серологическая диагностика вирусных инфекций основывается на исследовании парных сывороток, взятых в начале и в разгаре болезни или в периоде реконвалесценции с целью определения нарастания титра антител. Диагностически значимым считается нарастание титра антител в четыре раза и более.
Повышение чувствительности серологических методов достигается адсорбцией антигенов или антител на эритроцитах (РНГА, РОНГА, РТОНГА, РГадсТО, РРГ), меткой ферментами (ИФА), радиоактивными изотопами (РИА, РПГ) или флюорохромами (РИФ), Используется также принцип лизиса эритроцитов (как индикаторной системы) при взаимодействии антигенов и антител в присутствии комплемента (РСК, РРГ).
Реакция связывания комплемента (РСК) в виде варианта связывания комплемента на холоде (в течение ночи при температуре +4 0 С) часто применяетсяв вирусологии для ретроспективной диагностики ряда вирусных инфекций и для определения вирус-специфических антигенов в материалах от больных.
Реакция радиального гемолиза (РРГ) в агарозном гелеоснована на явлении гемолиза эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, под влиянием вирусспецифических антител в присутствии комплемента и применяется для серологической диагностики гриппа, ОРВИ, краснухи, паротита, тогавирусных инфекций.
Для постановки реакции к бараньим эритроцитам (0,3 мл 10%-й суспензии) добавляют 0,1 мл неразведенного вирусного антигена и смесь выдерживают 10 мин при комнатной температуре. К 1,2% агарозе при температуре 42 0 С добавляют 0,3 мл сенсибилизированных эритроцитов и 0,1 мл комплемента, смесь разливают на предметные стекла или в лунки полистироловых планшетов, в застывшем геле агарозы с помощью пробойника вырезают отверстия и заполняют их исследуемыми и контрольной сыворотками. Стекла или панели закрывают крышкой и помещают их во влажной камере на 16-18 часов в термостат. Учет реакции осуществляют по диаметру зоны гемолиза вокруг отверстий, заполненных сывороткой. В контроле гемолиз отсутствует.
11621 0
Серологические реакции обозначают в соответствии с феноменами, сопровождающими образование комплекса антиген — антитело при взаимодействии различных по свойствам компонентов. Различают реакции агглютинации, преципитации и лизиса.
Реакция агглютинации (РА)
Реакция агглютинации (РА) основана на применении корпускулярного антигена (взвесь бактерий, сенсибилизированных эритроцитов, частиц латекса и др.), взаимодействующего со специфическими антителами, в результате чего образующийся комплекс антиген - антитело выпадает в виде осадка. Эту реакцию широко применяют в лабораторной практике для серологической диагностики бактериальных инфекций и для идентификации выделенных микроорганизмов.
РА используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза (реакции Райта, Хеддльсона), туляремии, лептоспироза (РАЛ - реакция агглютинации и лизиса лептоспир), листериоза, сыпного тифа (РАР - реакция агглютинации риккетсий), шигеллеза, иерсиниоза, псевдотуберкулеза и др.
Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РИГА или РПГА).
Для постановки этой реакции используют эритроциты животных (барана, обезьяны, морских свинок, некоторых птиц), сенсибилизированных антителами или антигеном, что достигается инкубацией взвеси эритроцитов и раствора антигена или иммунной сыворотки.
Диагностикумы, полученные на основе эритроцитов, сенсибилизированных антигенами, называют антигенными эритроцитарными диагностикумами . Они предназначены для определения антител в серийных разведениях сывороток крови, например эритроцитарные шигеллезные диагностикумы, эритроцитарные сальмонеллезные О-диагностикумы.
Соответственно диагностикумы на основе эритроцитов, сенсибилизированных специфическими иммуноглобулинами, называют антительными (иммуноглобулиновыми) диагностикумами и они служат для выявления антигенов в различном материале, например эритроцитарный иммуноглобулиновый дифтерийный диагностикум для РИГА, применяемый для выявления дифтерийного экзотоксина коринебактерий в жидкой питательной среде при посеве в нее материала из носа и ротоглотки.
Реакцию гемагглютинации применяют для диагностики как бактериальных (брюшной тиф, паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), так и вирусных (грипп, аденовирусные инфекции, корь и др.) инфекций. По чувствительности и специфичности РИГА превосходит РА.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют для титрования противовирусных антител в сыворотках крови, а также с целью установления типовой принадлежности выделенных вирусных культур. РТГА можно применить для диагностики тех вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.
Принцип метода состоит в том, что сыворотка, содержащая антитела к конкретному типу вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность и эритроциты остаются неагглютинированными.
Реакция торможения (задержки) пассивной гемагглютинации (РТПГА).
В РТПГА участвуют три компонента: иммунная сыворотка, антиген (исследуемый материал) и сенсибилизированные эритроциты.
Если в исследуемом материале есть антиген, специфически реагирующий с антителами иммунной стандартной сыворотки, то он связывает их, и при последующем добавлении эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, гомологичным сыворотке, гемагглютинация не наступает.
РТПГА применяют для обнаружения микробных антигенов, для количественного их определения, а также для контроля специфичности РПГА.
Реакция латекс-агглютинации (РЛА)
В качестве носителя антител (иммуноглобулинов) используют частицы латекса. РЛА является экспресс-методом диагностики инфекционных болезней, учитывая время проведения (до 10 мин) и возможность обнаружить антиген в небольшом объеме исследуемого материала.
РЛА применяют для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типа b, Neisseria meningitidis в цереброспинальной жидкости, выявления стрептококков группы А в мазках из зева, для диагностики сальмонеллеза, иерсиниозов и других заболеваний. Чувствительность метода составляет 1-10 нг/мл, или 10³ -10⁶ бактериальных клеток в 1 мкл.
Реакция коагглютинации (РКоА)
Реакция коагглютинации (РКоА) основана на способности белка А стафилококков присоединять специфические иммуноглобулины. РКА - метод экспресс-диагностики - служит для выявления растворимых термостабильных антигенов в секретах человека и в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Обнаружение специфических антигенов в составе ЦИК требует их предварительного осаждения из сыворотки крови.
Реакция преципитации
В реакции преципитации (РП) в результате взаимодействия антител с высокодисперсными растворимыми антигенами (белки, полисахариды) образуются комплексы с участием комплемента - преципитаты. Это чувствительный тест, используемый для выявления и характеристики разнообразных антигенов и антител. Простейшим примером качественной РП является образование непрозрачной полосы преципитации в пробирке на границе наслоения антигена на иммунную сыворотку - реакция кольцепреципитации. Широко применяют различные разновидности РП в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез).
Реакция связывания комплемента (РСК)
Реакция связывания комплемента (РСК) основана на феномене гемолиза с участием комплемента, т.е. способна выявлять только комплементсвязывающие антитела.
РСК широко применяют для диагностики многих бактериальных и вирусных инфекций, риккетсиозов, хламидиозов, инфекционного мононуклеоза, протозойных инфекций, гельминтозов. РСК является сложной серологической реакцией, в которой участвуют две системы: исследуемая (сыворотка крови), представленная системой антиген - антитело и комплементом, и гемолитическая (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). Гемолитическая сыворотка представляет собой инактивированную прогреванием сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Она содержит антитела против эритроцитов барана.
Положительный результат РСК - отсутствие гемолиза - наблюдают в случае, если в исследуемой сыворотке содержатся антитела, гомологичные антигену. При этом образовавшийся комплекс антиген - антитело связывает комплемент, а в отсутствии свободного комплемента добавление гемолитической системы не сопровождается гемолизом. В случае отсутствия в сыворотке антител, соответствующих антигену, образования комплекса антиген - антитело не происходит, комплемент остается свободным и сыворотка вызывает гемолиз эритроцитов, т.е. наличие гемолиза - это отрицательный результат реакции.
Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.
ВИЧ-инфекция
ВИЧ-инфекция - заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), длительное время персистирующего в лимфоцитах, макрофагах, клетках нервной ткани, в результате чего развивается медленно прогрессирующее поражение иммунной и нервной систем организма, проявляющееся вторичными инфекциями, опухолями, подострым энцефалитом и другими патологическими изменениями.
Возбудители - вирусы иммунодефицита человека t-го и 2-го типов - ВИЧ-1, ВИЧ-2 (HIV-I, HIV-2, Human Immunodeficiency viruses, types I, 11) - относятся к семейству ретро- вирусов, подсемейству медленных вирусов. Вирионы являются сферическими частицами диаметром 100-140 нм. Вирусная частица имеет наружную фосфолипидную оболочку, включающую гликопротеины (структурные белки) с определенной молекулярной массой, измеряемой в килодальтонах. У ВИЧ-1 - это gp 160, gp 120, gp 41. Внутренняя оболочка вируса, покрывающая ядро, также представлена белками с известной молекулярной массой - р 17, р 24, р 55 (ВИЧ-2 содержит gp 140, gp 105, gp 36, p 16, p 25, p 55).
В состав генома ВИЧ входит РНК и фермент обратной транскриптазы (ревертазы). Для того чтобы геном ретровируса соединился с геномом клетки хозяина, вначале с помощью ревертазы происходит синтез ДНК на матрице вирусной РНК. Затем ДНК провируса встраивается в геном клетки-хозяина. ВИЧ обладает выраженной антигенной изменчивостью, значительно превышающий таковую у вируса гриппа.
В организме человека основной мишенью ВИЧ являются Т-лимфоциты, несущие на поверхности наибольшее количество CD4-рецепторов. После проникновения ВИЧ в клетку с помощью ревертазы по образцу своей РНК вирус синтезирует ДНК, которая встраивается в генетический аппарат клетки-хозяина (Т-лимфоциты) и остается там пожизненно в состоянии провируса. Помимо Т-лимфоцитов-хелперов, поражаются макрофаги, В-лимфоциты. клетки нейроглии, слизистой оболочки кишечника и некоторые другие клетки. Причиной снижения количества Т-лимфоцитов (клетки CD4) является не только прямое цитопатическое действие вируса, но и их слияние с неинфицированными клетками. Наряду с поражением Т-лимфоци- тов у больных ВИЧ-инфекцией отмечается поликлональная активация В-лимфоцитов с увеличением синтеза иммуноглобулинов всех классов, особенно IgG и IgA, н последующим истощением этого отдела иммунной системы. Нарушение регуляции иммунных процессов проявляется также повышением уровня альфа-интерферона, бета-2-микро глобулин а, снижением уровня интерлейкина-2. В результате нарушения функции иммунной системы, особенно при снижении числа Т-лимфоцитов (CD4) до 400 и менее клеток в 1 мкл крови, возникают условия для неконтролируемой репликации ВИЧ со значительным увеличением количества вирионов в различных средах организма. В результате поражения многих звеньев иммунной системы человек, зараженный ВИЧ, становится беззащитным перед возбудителями различных инфекций. На фойе нарастающей иммунодепрессии развиваются тяжелые прогрессирующие болезни, которые не встречаются у человека с нормально функционирующей иммунной системой. Эти болезни ВОЗ определила как СПИД-маркерные (индикаторные).
Первая группа - заболевания, которые присущи только тяжелому иммунодефициту (уровень CD4 ниже 200). Клинический диагноз ставят при отсутствии анти-ВИЧ антител или ВИЧ-антигенов.
Вторая группа - заболевания, развивающиеся как на фоне тяжелого иммунодефицита, так и в ряде случаев без него. Поэтому в таких случаях необходимо лабораторное подтверждение диагноза.
