Влияние лекарств на анализ крови методом ифа. Иммуноферментный анализ крови с расшифровкой показателей. Противопоказания для проведения

5.1 Сущность и классификация ИФА.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для индификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участие Е.Энгвалл и Р.Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р.Шурс.

Рис. 6 Основной принцип ИФА:

для выявления антигенов; 2) для выявления антител

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 6).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

5.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Образование конъюгата.

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

Высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

Достаточной специфичностью в рабочем разведении;

Преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

Оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

Достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

5.3 Гетерогенные методы ИФА.

Гетерогенные ИФА (или твердофазные ИФА) включают методы, в которых анализируемое соединение находится в двух фазах. Для разделения компонентов иммунохимической реакции используют твердую фазу (нерастворимый носитель, как правило, пластик) с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, которую отмывают на каждой стадии с целью удаления промежуточных продукто непрореагировавших компонентов.

Иммобилизацию можно проводить путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, а также путем физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров (например, полистирольных пластин). В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест или энзимсвязанный иммуносорбентный метод (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay).

Неконкурентный ИФА определения антигенов на примере использования меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител.

К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся антигенов и добавляют меченые антитела – конъюгат. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента, т. е. происходит ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству меченых ферментом специфических антител, фермента и, соответственно, исследуемого антигена. Измерения оптической плотности раствора в лунках при определенной волне (в зависимости от используемого субстрата) проводят с помощью специальных спектрофотометров, адаптированных для микропланшетов – ридеров. Количественную оценку концентрации антигена в пробе определяют, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного раствора антигена.

Рисунок 7.

Поскольку на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается связанным с молекулами иммобилизованных и меченых антител, в литературе этот метод часто называют «сэндвич»-метод (от англ. sandvich) или двухцентровый метод ИФА (от англ. two-site assay).

Этот метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых имеется, по крайней мере, две антигенные детерминанты. Для анализа большого количества моновалентных антигенов (лекарственных соединений, пестицидов и др.) он неприемлем.

Основное достоинство данного метода – высокая чувствительность. Предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что сказывается на длительности проведения анализа, которая в среднем составляет 4 – 6 часов. Неконкурентный ИФА определения антител на примере использования меченых ферментом вторичных антител и иммобилизованных антигенов.

К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и отмывания от несвязавшихся антител добавляют меченые вторичные антитела, которые специфичны к анализируемым антителам. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых вторичных антител содержание ферментной метки на носителе пропорционально концентрации специфических антител в сыворотки.

Данная схема является одной из наиболее распространенных ИФА определения антител, поскольку позволяет выявлять антитела к разным антигенам.

Гетерогенный конкурентный ИФА определения антигена на примере использования меченого антигена и иммобилизованных антител.

К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.



5.4 Гомогенный метод ИФА.

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) - наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА, занимает минуты и даже доли минут).

Рис. 8 Варианты гомогенного иммуноферментного анализа (А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело).

Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих времени этапов промывки. И наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток - на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, (несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.

5.5 «Сэндвич» - вариант ИФА для выявления антигенов.

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Диагностические методики современности дают возможность в условиях лаборатории выявить то или иное заболевание с помощью специальных анализов. К одним из таких стоит отнести иммуноферментный анализ крови, благодаря которому можно подтвердить предварительно поставленный диагноз.

Иммуноферментный анализ ИФА является одним из самых эффективных и современных способов, позволяющих выявить , нарушения, связанные с иммунными и гормональными сбоями, а также онкологические процессы. Во время проведения анализа в крови можно обнаружить антитела, вырабатывающиеся при наличии в организме инфекции. Учитывая этот нюанс, обнаружить болезнь можно даже на самом раннем этапе её развития.

Что лежит в основе методики

В основе результатов ИФА анализа лежит получение химических реакций на ферменты, служащие особенными опознавательными знаками для распознания антител. Следовательно, во время иммунохимических реакций антитела начинают взаимодействовать с некоторыми антигенами. Всё это даёт основания утверждать, что ложные результаты при сдаче крови на ИФА минимальны.

Исследование позволяет определить количество иммунных клеток, их свойства, а также наличие необходимых антител

Положительным результат считается тогда, когда обнаруживается окрашивание раствора. Окрас сигнализирует о том, что антигены взаимодействуют с антителом. В случае когда ничего подобного не происходит, результат является отрицательным.

Как проводится исследование методом ИФА

Механизм реакции

В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция антигена с антителом,а присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня.В упращенном виде механизм реакции можно представитьследующим образом:

	Первая реакция происходит между определяемым Ig (Ab) и очищенным антигеном возбудителя (Ag), фиксированным к поверхности лунок иммунологического планшета
	Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую иммунологичесую реакцию, в которой в качестве антигена выступает связавшийся специфический Ig, а в качестве антител к нему - коньюгат, представляющий собой Ig (Ab) к соответствующему Ig человека, меченный ферментом -пероксидазой (K)
	Далее происходит ферментативная реакция, катализируемая ферментной частью молекулы коньюгата.Субстратом данной реакции служит бесцветное вещество - хромоген, который в ходе реакции образует окрашенное вещество. Интенсивность окраски в лунке определенным образом зависит от количества содержащихся в пробе иммуноглобулинов.

Подсчет результатов

Проведение иммуноферментного анализа

Для серодиагностике используются 96 луночные полистирольные планшеты, на стенках ячеек которых заранее адсорбируется антиген. Исследуемая сыворотка вносится в ячейку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляются промыванием. Далее в ячейки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные ферментом. Если в исследуемой сыворотке присутствовали определяемые антитела, то они на этом этапе выступят в роли антигенов, с которыми прореагируют меченные антитела. Добавление после промывки хромогенного вещества (красителя) позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в ячейках. Интенсивность окраски при этом пропорциональна количеству фермента, а следовательно количеству антител.При измерении оптическую плотности (ОП) жидкости в ячейке и сравнивании ее с контрольным образцом подсчитывается концентрация антител в единицах объема.Наиболее часто применяется подсчет результатов в единицах оптической плотности.Надо учитывать,что для каждой тест-системы есть свои показатели учета результатов и показатели нормы и патологии на которые надо ориентироваться при интерпретации результатов.

Какие инфекции можно выявить методом ИФА

В основном в современной венерологии применяется для диагностики сифилиса (в комплексе с другими реакциями),ВИЧ-инфекции ,вирусных гепатитов .Имеет ограниченное значение для диагностики хламидийной инфекции ,цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций .Метод ИФА используется также для определения антител при различных инфекционных заболеваниях,уровня гормонов,аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний.

Как интерпретировать результаты ИФА

Исследование наличия и уровня антител различных классов в некторых случаях помогает определить стадии инфекционного процесса

Стадия заболевания	IgM	IgA	IgG
Первичная фаза (2 недели от инфицирования)
Первичная фаза (2,5 - 3 недели от инфицирования)
Первичная фаза (3-4 недели от инфицирования)
Обострение хронической фазы (2 недели от начала обострения)
Хроническая фаза
Прошедшая (излеченная инфекция)
Выздоровление		снижение титра в 2-4 раза после успешного лечения	снижение титра в 4-8 раз через 1-1.5 мес после успешного лечения
Отрицательный результат

К сожалению,такое важное преимущество ИФА, как количественное определение антител не имеет большого значения в практической работе - т.е. не позволяет точно установить диагноз и не влияет на дозировку и сроки назначения лекарственных средств.

Какая роль метод ИФА в диагностике сифилиса

Метод ИФА в диагностике сифилиса был впервые применен в 1975 год.В настоящее время он широко применяется для серологической диагностики сифилиса в России и используется как потверждающий тест на сифилис.Обычно проводят исследование,выявляющее так называемые суммарные антитела к антигенам бледной трепонемы (IgM и IgG),хотя в отдельных случаях возможно и определение только "ранних" антител класса М.ИФА при сифилисе становится положительным после 3 недели с момента инфицирования и остается положительным довольно длительное время даже после лечения (иногда всю жизнь).Поэтому как тест,подтверждающий излечение сифилиса,ИФА не используется.В большинстве случаев проводится только качественное определение ИФА - т.е. только положительный или отрицательный результат,хотя возможно и количественное определение.

Для того, чтобы определить уровень содержания таких биологически активных веществ, как , иммунологические комплексы, требуется провести специальное лабораторное исследование. При подозрении на наличие гематологического, инфекционного или поражающего аутоиммунную систему заболевания специалисты назначают анализ крови на ИФА. По ходу статьи мы с вами рассмотрим, что такое , как к нему подготовиться, что он показывает и как его расшифровать самому.

Что же это за исследование – анализ крови на ИФА? Аббревиатура расшифровывается как иммуноферментный анализ крови, в ходе которого определяется количественное и качественное содержание различных биологически активных веществ, а также антител и антигенов в биологическом материале.

Что используется при иммуноферментном анализе крови:

• спинномозговая жидкость;
• слизь уретры, цервикального канала;
• околоплодная жидкость;
• содержимое стекловидного тела.

Иммуноферментный анализ назначают с целью диагностирования заболеваний, которые передаются половым путем, инфекционных и онкологических процессов, аллергических реакций, расстройств в работе эндокринной и репродуктивной системах, аутоиммунных и иммунодефицитных заболеваний, а также для оценивания риска развития некоторых , почек.

Обследование крови на ИФА при беременности назначают с целью раннего выявления , нарушений развития на начальных стадиях и контроля их динамики. Кроме того, анализ ИФА позволяет контролировать уровень содержания антител, способных спровоцировать развитие у ребенка тяжелых неврологических расстройств, тем самым предотвращая развитие осложнений не только во время беременности, но и в процессе родов.

Дает возможность заблаговременно отреагировать на выявленные проблемы и в значительной мере укрепить здоровье, как самой мамы, так и ее малыша.

Преимущества ИФА крови относятся:

• высокая (до 90%) степень чувствительности;
• возможность раннего установления диагноза, с одновременным определением стадии заболевания;
• невысокая стоимость реагентов, а, следовательно, доступность;
• минимальное количество материала для исследования;
• минимальные сроки получения ;
• возможность длительного хранения реагентов;
• способность контролировать динамику развития патологического процесса.

Тест-системы

Минусы иммуноферментного анализа:

• нельзя конкретизировать возбудителя заболевания, в лаборатории получают только иммунный ответ на него
• возможность получения ложного результата (в очень редких случаях, преимущественно в период вынашивания беременности).

Подготовка

Принцип данного вида исследования крови базируется на образовании в организме человека специфических антител при попадании в него антигенов, то есть чужеродных агентов, вызывающих развитие того или иного заболевания. В результате их взаимодействия образуются комплексы «антиген - антитело», которые и подвергаются исследованию при осуществлении иммуноферментного анализа.

В связи с этим, чтобы не повлиять на данные комплексы и, соответственно, на достоверность полученных результатов, анализ крови и другого биологического материала на ИФА требует определенной подготовки.

Также за 14 дней до предполагаемого обследования специфическое лечение приостанавливается и употребление антибактериальных, противовирусных лекарственных препаратов прекращается.

Кровь на ИФА сдается из вены. Непосредственно перед забором крови следует ограничить физические нагрузки, а также исключить курение и употребление алкогольных напитков.

Существует несколько методик и способы проведения иммуноферментного анализа: прямой и непрямой способ, конкурентный и метод блокирования.

В основе проведения обследования крови (любого другого биологического материала) на ИФА лежит алгоритм, заключающийся в осуществлении двух реакций – иммунной и ферментативной.

В ходе первой патологические агенты связываются с защитными элементами клеток биологического материала, взятого для исследования. Образуется иммунный комплекс «антиген - антитело». Выглядит это следующим образом. Антигены присутствуют на поверхности абсолютно всех клеток.

При попадании в организм чужеродных клеток происходит их захват иммунными клетками (на чьих поверхностях располагаются антитела), которые сопоставляют данные об антигенах с поверхности вновь поступивших клеток с информацией, заложенной в собственной «памяти». В случае несовпадения этих данных включаются защитные функции организма, заключающиеся в образовании иммунного комплекса.

После этого осуществляют ферментативную реакцию, которая визуализирует результаты предшествующей реакции. Ее принцип основывается на превращении вещества из одного в другое. Для каждого вида ИФА образующего в процессе иммунной реакции материала существует определенный фермент, обработку которым используют для определения концентрации чужеродного агента (по интенсивности окрашивания раствора).

Расшифровка

Благодаря анализу крови на ИФА, лаборанты определяют A, G и M. Положительный результат при исследовании крови (другого биологического сырья) на ИФА дает возможность не только поставить диагноз, но и стадию заболевания, а также характер его протекания (острое или хроническое).

Данные иммуноглобулины при наличии в организме пациента патологического процесса образуются в различные периоды заболевания:

• Иммуноглобулины М, IgM – образуются через пять дней после начала заболевания и сохраняются в крови в течение 1,5 месяца, после чего исчезают. Выявление IgM указывает на наличие в организме острого первичного патологического процесса и необходимости усиленного терапевтического вмешательства.
• Иммуноглобулины G, IgG – возникают спустя четыре недели с момента инфицирования, их наличие в организме можно выявить на протяжении нескольких месяцев. Выявление IgG указывает на наличие в анамнезе человека перенесенного заболевания. Повышение уровня их содержания может свидетельствовать также о повторном заражении.
• Иммуноглобулины А, IgA – появляются в момент заражения и присутствуют в организме в течение четырех недель. Снижение их содержания говорит о начале выздоровления. Появление в анализах вновь после того, как человек прошел курс лечения и выздоровел, свидетельствует о переходе заболевания в хроническую форму. Одновременное выявление в результатах ИФА IgA и IgG также говорит о наличии в организме хронического процесса.

Следует также отметить, что одновременное присутствие в анализах IgG и IgМ указывает на то, что хронический процесс обострился, и пациенту требуется начать лечение. Если же ни один из иммуноглобулинов в ходе обследования не был выявлен, это означает отсутствие иммунного ответа.

Развитие современной медицины в мире диагностики не перестает удивлять своими достижениями, и теперь врачу нет необходимости высказывать предположения о вероятном диагнозе, опираясь лишь на косвенные признаки. Создание и введение в мир лабораторных исследований иммуноферментного анализа крови (ИФА) позволяет быстро и точно определить не только наличие возбудителя, но и многие другие характеристики заболевания.

История создания и развития ИФА

Данный метод исследования крови стал применяться в практической медицине еще в середине прошлого столетия – где-то в 60-х годах. Изначальной его целью были научные исследования в области гистологии, которые ограничивались поиском и изучением клеточной антигенной структуры биологических видов. Анализ крови методом ИФА основан на взаимодействии родственных антигенов (АГ) и специфических антител (АТ), с формированием комплекса «антиген-антитело», определяемого ферментом.

Такой феномен подтолкнул ученых к решению, что способ можно применять для распознавания белковых соединений различных классов, образующихся в сыворотке крови при попадании в организм возбудителя. Из-за своей непосредственной вовлеченности в функционирование иммунной системы эти соединения получили название иммуноглобулины (ИГ, Ig), а открытие стало величайшим прорывом в лабораторной диагностике.

При этом активно использовать этот высокочувствительный метод стали лишь в 80-х годах, и доступен он был только в узкоспециализированных медицинских учреждениях. Самыми первыми получили возможность пользоваться иммуноферментными анализаторами станции и центры переливания крови, венерологические и инфекционные лечебные заведения. Это было связано со стремительным распространением «чумы XX века» – СПИДа, и требовалось срочное принятие диагностических и терапевтических мер.

Возможности методики

Область применения анализа крови на ИФА довольно широка – на данный момент невозможно и представить, насколько бы усложнились поиски причины множества заболеваний. Такое исследование теперь применяется практически во всех медицинских отраслях, даже в онкологии. Хоть для неосведомленных это сложно понять, но в отдельных случаях проведя его, удалось спасти жизнь пациентам, обнаружив опухоль на ранних стадиях.

Важно! ИФА – анализ крови, который показывает маркеры, характерные для некоторых злокачественных процессов, что позволяет обнаружить заболевание на том временном этапе, когда никакому другому способу это неподвластно.

В современных диагностических центрах, лабораторные обследования представлены не только онкомаркерами – они снабжены внушительным арсеналом панелей для проведения данной диагностики. С их помощью можно определить множество патологических состояний, таких как гормональные отклонения и инфекционные процессы различного происхождения.

Кроме этого, проведение и расшифровка анализа крови ИФА даст возможность отследить действие медицинских препаратов на организм больного человека и даже животного. Последнее широко применяется в ветеринарных клиниках, помогая сохранить здоровье нашим домашним питомцам либо кормильцам, обеспечивающим стабильное поступление мясной, молочной продукции и незаменимых в рационе яиц.

Так, в результате забора всего нескольких миллилитров венозной крови и ее диагностики методикой ИФА, врач, описав материалы исследования, сможет определить:

• гормональное состояние, включающее биологически активные вещества половых и щитовидной желез, а также надпочечников;
• наличие бактериальной и вирусной инфекции (гепатит В и С, сифилис, герпес, хламидиоз, туберкулез, мико- и уреаплазмоз, ВИЧ, TORCH) и другие заболевания данной природы;
• признаки жизнедеятельности возбудителей патологического процесса, завершившегося выздоровлением и перешедшего в стадию образования антител (иммунного ответа).

Такие комплексы гораздо проще распознаются и ликвидируются клетками иммунитета. Остаточные явления в виде антител во множественных случаях содержатся в крови пожизненно, что практически сводит риски повторного заражения к нулю.

Разновидности иммуноглобулинов

Существует несколько видов антител, причем каждый из них вовлекается в процесс иммунного ответа на определенном этапе. К примеру, первыми в ответ на попадание АГ в организм образовываются иммуноглобулины класса М (IgM). Самые высокие их показатели наблюдаются в первые дни заболевания.

Виды используемых при ИФА иммуноглобулинов

Затем иммунная система запускает в плазму ИГ класса G (IgG), ответственные за полное уничтожение антигенов и выздоровление больного. Позже они так и продолжают находиться в крови, тем самым подготавливая иммунитет к повторному попаданию идентичного возбудителя. По такому принципу работает вакцинация. При введении ослабленных антигенов патологических микроорганизмов, в плазме появляется и остается циркулировать много иммуноглобулинов.

Основными интересующими объектами для лабораторной диагностики считаются Ig классов M, G и A. По уровню их концентрации можно определить стадию заболевания и узнать, какими инфекционными болезнями человек болел в своей жизни. Например, можно проверить была ли в анамнезе ветряная оспа или краснуха. Врачу, чтобы узнать присутствует ли определенный вид АТ или АГ в организме пациента или концентрацию какого-либо гормона, нет необходимости назначать множественные лабораторные обследования – достаточно выписать направление на ИФА.

Суть методики

Методика исследования строится на нескольких вариантах (прямой и непрямой – конкурентный и неконкурентный) выполнения поставленных задач, причем каждый из них предназначен для определенных целей. Такой подход позволяет производить целенаправленный поиск, и в кратчайшие сроки выявлять причину той или иной патологии. Для обнаружения Ig разных классовых категорий применяется 96-луночный планшет (полистироловая панель), а в его лунках расположены сорбированные рекомбинантные белки. Они исполняют роль антигенов, и на начальном этапе находятся в твердой фазе.

При попадании в лунку с плазмой крови, антигены или антитела идентифицируют в связи со своей направленностью объект, и формируют комплекс (АГ – АТ). Данное образование закрепляется ферментным соединением (коньюгатом), который впоследствии проявится измененным окрашиванием лунки. ИФА производится на специфических тест-системах, изготовленных в профильных лабораториях и укомплектованных полным набором реагентов.

Данный анализ можно выполнять на вошерах – промывных аппаратах и считывающих спектрофометров, но они требуют ручного труда. Безусловно, лаборанту в несколько раз удобнее и быстрее осуществлять все манипуляции на полностью автоматизированных приборах. При их использовании сотрудники лаборатории освобождаются от большого объема монотонной деятельности – промывания, закапывания и остальной рутины, но не все лечебные учреждения могут себе позволить такую дорогостоящую аппаратуру

Поэтому многие больницы и диагностические заведения продолжают осуществлять ИФА по старинке – на полуавтоматах.

Интерпретация материалов исследования исключительно компетенция специалиста лабораторной диагностики – только ему могут рассказать результаты о специфике и тонкостях протекания заболевания. При этом врач должен обязательно учесть возможность получения ложноотрицательных или ложноположительных ответов.

Расшифровка материалов

Итогом качественной иммуноферментной диагностики должно стать однозначное заключение – найден искомый микроорганизм или нет в данном образце крови. Количественный анализ будет указывать на уровень концентрации и может выражаться двумя способами – значением в цифрах либо количеством знаков «+».

Анализируемые показатели

В процессе исследования производится тщательное изучение основных иммуноглобулинов, вовлеченных в иммунный ответ, таких как:

• IgM – обнаружение данного класса означает развитие острой формы инфекционного заболевания. Отрицательный результат по поиску IgM может быть как свидетельством отсутствия искомого возбудителя, так и перехода болезни в хроническое течение.
• IgА – определение этого класса при отсутствии IgM в большинстве случаев сигнал о хронической либо скрытой форме развития инфекционной болезни.
• IgM и IgА (одновременное наличие) – положительные результаты на оба вида свидетельствует о самом пике острой формы патологии.
• IgG – его наличие указывает на трансформацию заболевания в хроническую форму либо на выздоровление и формирование иммунитета к определяемому агенту.

Появление и накопление определенного класса ИГ происходит на разных временных этапах. Так, к примеру, первыми появляются IgM, приблизительно на 5 день от попадания возбудителя. ИГ находятся в крови около 5–6 недель, и затем постепенно пропадают. В это время они доступны к определению посредством ИФА. Ориентировочно через 3–4 недели от начала болезни появляются IgG, которые впоследствии могут оставаться на протяжении нескольких месяцев. Но в анализе их не всегда удается обнаружить.

IgА образуются в крови в период 2–4 недели, при этом 20% их содержится в сыворотке, а 80% – в секрете слизистых оболочек. Как правило, эти иммуноглобулины пропадают на протяжении 2–9 недель, что свидетельствует об уничтожении возбудителя и выздоровлении больного. Если же ИФА все же показывает наличие IgА, то это сигнализирует о переходе процесса в хроническую форму.

Варианты результатов анализа

В зависимости от полученных данных, ответы ИФА могут быть выданы на бланке в виде таблицы с полным списком всех АТ и АГ и указанием положительной либо отрицательной реакции. В определенных ситуациях будет выведено количественное значение – резко положительный, положительный, слабоположительный или отрицательный результат. Второй вариант указывает на количество содержащихся АТ в изучаемом образце крови.

Варианты интерпретации материалов ИФА

Кроме вышеперечисленных значений, в процессе ИФА исследуется еще один количественный параметр – индекс авидности АТ, исчисляющийся в процентах. Он показывает, сколько длится заболевание – то есть чем выше показатель, тем больше времени идет развитие патологии.

Альтернативный способ ИФА

Иммуноферментный анализ крови – достаточно известная и распространенная диагностика. Возможно, о ней никогда и не слышали некоторые, но существует одна еще менее известная широкому кругу людей разновидность данного исследования, при котором берется образец не крови. Эта методика называется анализ кала на скрытую кровь, и во многих случаях она позволяет избежать дополнительных изнуряющих процедур, к тому же еще сопровождающихся неприятными ощущениями.

Анализ ИФА на скрытую кровь (молекулы гемоглобина) дает возможность обнаружить кровотечение органов пищеварительной системы, даже незначительное, признаки которого в стуле больного, как говорится, невооруженным глазом не найти. Иммуноферментный анализ скрытой крови в испражнениях человека за короткое время способен показать язвенную болезнь, полипоз, дивертикулез, опухоли, которые на ранних стадиях не сопровождаются определенной симптоматикой.

На сегодняшний день созданы тысячи разновидностей тест-систем иммуноферментной диагностики, которые предоставляют возможность находить АТ и АГ огромного списка патологий. Поэтому данный анализ применяется почти во всех отраслях медицины, для любой возрастной категории. А абсолютная безвредность позволяет прибегать к нему и при беременности, и для диагностики ослабленных пациентов.