Сущность реакции заключается в том, что находящийся в мясе фермент пероксидаза разлагает перекись водорода с образованием кислорода, который и окисляет бензидин. При этом образуется парахинондиимид, который с недоокисленным бензидином дает соединение (парахинондиимид) сине-зеленого цвета, переходящего в бурый.
В ходе этой реакции важное значение имеет активность пероксидазы. В мясе здоровых животных она весьма активна, в мясе больных и убитых в агональном состоянии активность ее значительно снижается.
Пероксидаза + бензидин + 2H 2 O 2 + бензидин
парахинондиимид (сине-зеленый цвет, переходящий в буро-коричневый).
Техника определения. В пробирку наливают 2 мл мясной вытяжки в соотношении 1:4 (приготовленная для определения рН колориметрическим способом), приливают 5 капель 0,2%-ного раствора бензидина, взбалтывают и добавляют 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода.
Оценка результатов. При положительной реакции мясная вытяжка через 0,5 - 1,5 минуты приобретает сине-зеленый цвет, который быстро переходит в буро-коричневый. Такая реакция свойственна мясу, полученному от здорового животного.
Слабо положительная реакция (сомнительная). Вытяжка из мяса переутомленных, старых и заболевших животных приобретает сине-зеленый цвет, который с задержкой переходит в буро-коричневый.
Отрицательная реакция. В вытяжке из мяса тяжело больных или убитых в агональном состоянии животных сине-зеленый цвет не появляется, и вытяжка сразу приобретает буро-коричневый оттенок.
6.5 Формольная реакция (по г.В. Колоболотскому и е.В. Киселеву)
При тяжело протекающих заболеваниях, еще при жизни животного, в мышцах в значительном количестве накапливаются промежуточные и конечные продукты белкового обмена – полипептиды, пептиды, аминокислоты и др. Сущность данной реакции заключается в осаждении этих продуктов обмена формальдегидом.
Техника определения. Для постановки реакции необходима водная вытяжка из исследуемого мяса в соотношении 1:1. Для приготовления вытяжки 1:1 пробу мяса освобождают от жира и соединительной ткани и отвешивают 10 г. Затем навеску помещают в ступку, тщательно измельчают изогнутыми ножницами, приливают 10 мл физиологического раствора и 10 капель 0,1 Н раствора едкого натра.
Мясо растирают пестиком. Полученную кашицу переносят с помощью стеклянной палочки в колбу и нагревают до кипения для осаждения белков. Колбу охлаждают холодной водой под краном, после чего, ее содержимое нейтрализуют добавлением пяти капель 5%-ного раствора щавелевой кислоты и пропускают в пробирку через фильтровальную бумагу. Если вытяжка после фильтрации остается мутной, фильтруют вторично или центрифугируют.
Выпускаемый промышленностью формалин имеет кислую среду, поэтому его предварительно нейтрализуют 0,1 Н едким натром по индикатору, состоящему из равной смеси 0,2%-ных водных растворов нейтральрота и метиленового голубого до перехода цвета из фиолетового в зеленый.
Для реакции в пробирку наливают 2 мл вытяжки и добавляют 1 мл нейтрального формалина.
Оценка результатов. Положительная реакция. Вытяжка, полученная из мяса животного, убитого в агонии, тяжело больного или разделанного после падежа, превращается в плотный сгусток.
Сомнительная реакция. В вытяжке из мяса утомленного или заболевшего животного выпадают хлопья.
Отрицательная реакция. Вытяжка из мяса здорового животного остается прозрачной или слабо мутнеет.
Мясо считается полученным от здорового животного при наличии хороших органолептических показателей туши, отсутствии патогенных микробов, рН 5,7 - 6,2, положительной реакции на пероксидазу и отрицательной формольной реакции. Мясо больного, а также переутомленного животного недостаточно обескровлено, рН 6,3 - 6,5 реакция на пероксидазу отрицательная, а формольная проба - положительная (хлопья). Мясо животного, убитого в состоянии агонии, плохо обескровлено, с синюшной или сиреневато-розовой окраской лимфатических узлов, рН 6,6 и выше, реакция на пероксидазу отрицательная, а формольная реакция сопровождается образованием желеобразного сгустка.
Таблица 2 Лабораторные показатели мяса здоровых и больных животных
|
Показатели |
Мясо здоровых животных |
Мясо утомленного и заболевшего животного |
Мясо тяжело больного животного или убитого в агональном состоянии |
|
1.Бактериоскопия мазков-отпечатков |
Микрофлора отсутствует |
Единичные кокки или бактерии |
Имеются кокки, палочки |
|
2. рН мясной вытяжки |
6,6 и выше |
||
|
3. Реакция на пероксидазу |
Положительная (сине-зеленое окрашивание, быстро переходящее в буро-коричневое) |
Сомнительная или слабо положительная (сине-зеленое окрашивание с задержкой, переходящее в буро-коричневое) |
Отрицательная (сине-зеленый цвет не появляется, а вытяжка сразу приобретает буро-коричневый цвет) |
|
4. Формольная проба (для мяса крупного рогатого скота) |
Отрицательная (вытяжка остается прозрачной или слабо мутнеет) |
Сомнительная (выпадают хлопья) |
Положительная (образуется плотный сгусток) |
В присутствии перекиси водорода и пероксидазы бензидин образует более сложное соединение из двух молекул, окрашенное в синий цвет. Оно постепенно разлагается с образованием бурого вещества.
Недостатком бензидиновой реакции является ее диффузность. Для ее устранения к реактиву добавляют молибденовокислый аммоний, который осаждает окрашенное вещество.
Реактивы
1) 0,85%-ный раствор поваренной соли.
2) 0,1%-ный раствор молибденовокислого аммония на солевом растворе.
3) Насыщенный раствор бензидина в солевом растворе.
4) 20%-ный раствор перекиси водорода.
5) Смесь перекиси водорода с бензидином из расчета 1 капля перекиси водорода на 2 мл бензидина (смешать перед употреблением).
Проведение реакции
1. Поместить срезы в 0,85%-ный раствор поваренной соли при 4° С в часовом стекле на 3 мин.
2. Обработать срезы раствором 0,1%-ного молибденовокислого аммония в солевом растворе в течение 5 мин.
3. Обработать срезы раствором бензидина, смешанного перед употреблением с перекисью водорода, в течение 5 мин (до появления синей окраски).
4. Промыть срезы свежим охлажденным солевым раствором.
5. Наблюдать локализацию синей окраски.
Результаты реакции (табл. 28, 29)
В листе капусты в местах скопления активной пероксидазы выпадают синие кристаллы. Реакция идет во всех тканях листа с заметной интенсивностью, причем более или менее равномерно во всей паренхиме. В пучках особенно интенсивно красится флоэмная часть. Камбий окрашивается значительно слабее. Обилие пероксидазы во флоэме, по-видимому, объясняется тем, что пластические вещества, передвигающиеся по клеткам, подвергаются частичному окислению и расходуются на синтез веществ новых клеток, образуемых камбием.
В зерновке кукурузы реакция протекает с незначительной интенсивностью. В зародыше окраска почти такая же слабая, как и в эндосперме. Более интенсивная окраска характеризует проводящие элементы. Окраска цитоплазмы клеток, дающих реакцию, неравномерна, пластиды окрашиваются значительно сильнее, чем цитоплазма.
Сущность реакции.
Заключается она в том, что нахоящийся в мясе фермент пероксидаза разлагает перекись водорода с образованием кислорода, который и окисляет бензидин. При этом образуется парахинондиимид, который с неодокисленым бензидином дает соединение сине-зеленого цвета, переходящего в бурый. В ходе этой реакции, важное значение имеет активность пероксидазы. В мясе здоровых животных она весьма активна, в мясе больных и убитых в агональном состоянии активность ее значительно снижается.
Техника постановки реакции.
В пробирку наливают 2мл вытяжки (1:4), приливают 5 капель 0.2% спиртового раствора бензидина, взбалтывают и добавляют 2 капли 1% раствора перекиси водорода.
В рассоле.
Реакцию на пероксидазу применяют как дополнительный метод исследования, она дает четкий результат при постановке с неразведенным рассолом.
Рассол из доброкачественной солонины - окрашивается в сине-зеленый цвет; в рассолах из солонины начальных стадий порчи - сине-зеленый цвет появлятся с большой задержкой, а в рассолах несвежей солонины - не появляется вообще. С пробами рассола положительная реакция на пероксидазу отмечается при рН до 6.4 – 6.5; при рН рассола 6.6 реакция бывает сомнительной, а при рН 6.6 и выше – и отрицательной.
В солонине.
Вытяжка из свежей солонины - окрашивается в сине-зеленый цвет в течение 1 мин, в сомнительных случаях слабое позеленение наступает в течение 1-2 мин и сразу же переходит в бурый цвет. Цвет вытяжки из несвежих продуктов - не изменяется. Положительный результат реакции на пероксидазу обнаруживают в вытяжках, имеющих рН 6.4, при рН от 6.4 до 6.5 реакция слабо положительная и выше 6.5 – отрицательная.
При отсутствии гнилостной порчи отрицательная реакция на пероксидазу дает основание предполагать, что солонина приготовлена из мяса больных животных.
7. Методика определения продуктов первичного распада белков в бульоне
Сущность метода. Метод основан на осаждении белков нагреванием, образовании в фильтрате комплексов сернокислой меди с продуктами первичного распада белков, выпадающих в осадок.
Порядок выполнения работы.
Горячий бульон фильтруют через фильтровальную бумагу в пробирку, помещенную в стакан с холодной водой. Если после фильтрации в бульоне остаются хлопья белка, бульон дополнительно фильтруют. В пробирку наливают 2 мл фильтрата и добавляют 3капли 5% раствора сернокислой меди. Встряхивают 2-3 раза и ставят в штатив. Через 5 мин записывают результаты анализа.
Санитарная оценка.
Мясо свежее – бульон остается прозрачным.
Мясо сомнительной свежести – бульон мутнеет
Мясо несвежее – в бульоне выпадает желеобразный осадок, а в бульоне из размороженного мяса – крупные хлопья.
8. Методика определения аммиака по Неслеру в солонине
Сущность метода. Метод основан на способности аммиака и солей аммония образовывать с реактивом Неслера йодид меркураммония – вещество, окрашенное в желто-бурый цвет.
Порядок выполнения работы.
Навеску фарша массой 5г переносят в коническую колбу с 20мл дистиллированной воды и настаивают в течение 15мин при 3 х -кратном взбалтывании. Полученную вытяжку фильтруют.
В пробирку вносят пипеткой 1мл вытяжки и добавляют 10 капель раствора Неслера. Содержимое пробирки взбалтывают, наблюдают изменение цвета и устанавливают прозрачность вытяжки.
Санитарная оценка.
Солонина считается свежей – если вытяжка приобретает зеленовато-желтый цвет, остается прозрачной или слегка мутнеет.
Солонина считается сомнительной свежести – если вытяжка становится интенсивно желтого цвета, значительно мутнеет.
Солонина считается несвежей – если вытяжка окрашивается в желто-оранжевый цвет, быстро образуются хлопья, выпадающие в осадок.
9. Методика определения сероводорода в солонине
Порядок выполнения работы.
В широкую пробирку рыхло накладывают 15-20г фарша солонины. На полоску фильтровальной бумаги наносят каплю 10% щелочного раствора уксуснокислого свинца. Полоску бумаги закрепляют пробкой так, чтобы она свешивалась до середины пробирки. Пробирку помещают в водяную баню (50-55ºС) и выдерживают 15мин, бумажку вынимают и читают реакцию.
Санитарная оценка.
Если мясо свежее – капля не окрашивается или становится слабо-бурого цвета.
Мясо сомнительной свежести – капля окрашивается в буро-коричневый цвет.
Мясо несвежее – в темно-коричневый.
10.Методика определения поваренной соли в солонине по методу Мора.
Сущность метода. Метод основан на титровании иона хлора ионом серебра в нейтральной среде и в присутствии хромата калия.
Порядок выполнения работы.
5г измельченной пробы взвешивают в химическом стакане и добавляют 100мл дистиллированной воды. Через 40мин настаивания водную вытяжку фильтруют через бумажный фильтр. 5-10мл фильтрата пипеткой переносят в коническую колбу и титруют из бюретки 0.05н. раствором азотнокислого серебра в присутствии 0.5мл раствора хромовокислого калия до появления оранжевого окрашивания.
Навеску полукопченых, варено-копченых, копченых колбас, соленого бекона, продуктов из свинины, баранины и говядины (сырокопченых, копчено-вареных, копчено-запеченных, запеченных и зажаренных) нагревают в стакане на водяной бане до 40ºС, выдерживают при в течение 45 мин. и фильтруют через бумажный фильтр. Далее как выше указано титруют.
Самостоятельная работа: ход выполнения АКР .
Задание. Объяснить сущность консервирования мяса поваренной солью. Кратко дать характеристику посола, как одного из самых древних, широко распространенных и доступных методов консервирования.
Посол мяса – когда-то его считали основным методом. В связи с развитием холодильной техники, использованием высоких температур для консервирования мяса и мясопродуктов, развитием колбасного производства посол уступил 1–ое место этим методам консервирования. Им пользуются при производстве бекона, шпика, мясокопченостей, в колбасном производстве как вспомогательным методом.
Посол относится к химическим методам консервирования мяса. Сущность его подчинена закону диффузии, в основе которого лежит осмотически диффузионный процесс. Для посола используют рассол – водный раствор поваренной соли. Из-за разности в осмотическом давлении внутри тканевых клеток мяса и рассола, в котором находится мясо, происходит диффузия; в мясо проникает соль и др. ингридиенты, а из мяса в рассол переходит вода и растворимые в ней органические соединения.
В сравнении с другими видами консервирования мяса солонина жестче (за счет обезвоживания тканей), содержит от 6 до 12% соли, теряет часть белков, фосфатов и других экстрактивных веществ.
В пробирку наливают 2 мл фильтрата, 5 капель 0,2%-ного спиртового раствора бензидина и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода.
Вытяжка из свежего мяса здоровых животных приобретает зелено-синий цвет, переходящий через несколько минут в бурый. В вытяжках из мяса больных, переутомленных и убитых в агонии животных цвет не изменяется, но иногда зелено-синий цвет появляется, с большой задержкой и быстро переходит в бурый.
Реакцию на пероксидазу можно ставить и без приготовления вытяжки: на свежий разрез мяса наносят 2 капли 1%-ного р-ра перекиси водорода и 5 капель 0,2%-ного р-ра бензидина. Появление сине-зелёного пятна с последующим переходом в бурое расценивают как положительную реакцию, отсутствие цветного пятна считают за отрицательную реакцию.
ФОРМОЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ
Мясо животных, убитых после длительной агонии или тяжёлого патологического состояния, можно распознать по показателям формольной реакции..
Пробу мяса освобождают от жира и соединительной ткани. Навеску в 10 г помещают в ступку, тщательно измельчают ножницами, приливают 10 мл физ. р-ра и 10 капель 0,1 н едкого натрия. Мясо растирают пестиком. Полученную кашицу переносят стеклянной палочкой в колбу и нагревают до кипения для осаждения белков. Колбу охлаждают водопроводной водой, после чего содержимое её нейтрализуют добавлением 5 капель 5%-ного р-ра щавелевой кислоты и пропускают в пробирку через фильтровальную бумагу. Мутную вытяжку фильтруют вторично или центрифугируют.
Ход реакции. В пробирку наливают 2 мл вытяжки и добавляют 1 мл нейтрального формалина.
Вытяжка из мяса животного, убитого в агонии, тяжело больного или разделанного после падежа, превращается в плотный сгусток; в вытяжке из мяса больного животного выпадают хлопья, вытяжка из мяса здорового животного остается жидкой и прозрачной, иногда появляется слабое помутнение.
Формалин предварительно нейтрализуют 0,1 н едким натрием по индикатору, состоящему из равной смеси 0,2%-ных водных растворов нейтральрота и метиленового голубого до перехода цвета из фиолетового в зеленый.
Санитарная оценка мяса
Проводится по результатам исследования и заносится в рабочую тетрадь.
При выявлении признаков, свидетельствующих о том, что животное убито во время агонии (гипостазы, плохое обескровливание, отсутствие реакции на месте зареза), туши и органы подлежат технической утилизации.
В мясе от здорового животного отсутствуют патогенные микроорганизмы, рН в пределах 5,7-6,2, реакция на пероксидазу положительная.
Подозрительным в происхождении от больного или вынужденно убитого животного считается мясо при рН 6,3 и выше и отрицательной реакции на пероксидазу.
ВИДОВАЯ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ МЯСА
Попытка выдать мясо одного вида животного за мясо другого вида животного, как правило, более ценного называется видовой фальсификацией и может иметь место на рынках в торговой сети и учреждениях общественного питания. Поэтому ветеринарный врач обязан уметь определять видовую принадлежность мяса. Обычно при видовой фальсификации используют туши животных, схожих по размеру, форме и другим показателям. Так конину обычно пытаются выдать за говядину и наоборот (в некоторых странах где конина ценится выше), туши крупных собак выдают за бараньи, кошек пытаются выдать за кроликов и нутрий. Для определения видовой принадлежности мяса используют объективные и субъективные методы.
Субъективные методы определения видовой принадлежности мяса. К субъективным методам относят такие как конфигурация, морфологические и органолептические показатели мяса и др.
Органолептические показатели
Определение по цвету мяса
Цвет мяса и структура мышечной ткани зависят от возраста, пола, упитанности животных и других причин.
Мясо крупного рогатого скота может быть от светло красного до темно красного, на поперечном разрезе крупнозернистое.
Мясо лошадей темно красного
После варки мясо свиней и телят приобретает белый или светло-серый цвет, мясо крупного рогатого скота, овец и лошадей - темно-серый цвет.
Метод основан на способности фермента пероксидазы принимать участие в процессах окисления за счет кислорода пероксида водорода. Присутствие пероксидазы устанавливают, используя реакции с гваяколом, бензидином, амидопирином (пирамидоном). При температуре 80 °C пероксидаза инактивируется. Следовательно, если в исследуемом изделии пероксидаза обнаруживается, тепловая обработка считается недостаточной.
Аппаратура, материалы, реактивы . Весы лабораторные; пробирки химические диаметром 15 мм; пробки корковые; штатив для пробирок; ступка фарфоровая диаметром 7 - 9 см; капельницы; часы песочные на 1, 2 мин.; воронки стеклянные диаметром 4 - 5 см; пипетки вместимостью 1 и 20 см 3 ; колбы конические вместимостью 50 и 100 см 3 ; бумага фильтровальная; вата; гваякол, спиртовой раствор с массовой долей 1% (1 г гваякола растворяют этиловым спиртом в мерной колбе на 100 см 3); бензидин, спиртовой раствор с массовой долей 0,02% (20 мг бензидина растворяют в 100 см 3 этилового спирта); амидопирин, спиртовой раствор с массовой долей 2% (2 г амидопирина растворяют в 98 см 3 этилового спирта); спирт этиловый; пероксид водорода (30 - 35%), раствор с массовой долей 10%; кислота уксусная ледяная; ацетат натрия безводный; вода дистиллированная.
Проведение испытания . Окислительно-восстановительные свойства пероксидазы проявляются в строго определенном интервале pH. Наиболее интенсивная окраска наблюдается в интервале значений pH от 4,4 до 6,9; менее интенсивная при pH 3,4 и выше; не проявляется при pH выше 10,4.
При анализе используют ацетатный буферный раствор с pH 4,9.
Измельченную навеску, взятую из внутренней части жареного изделия в количестве 10 г и взвешенную с точностью до 0,01 г, растирают в ступке с 20 см 3 дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр или слой ваты в коническую колбу. Затем отбирают в пробирку 0,5 см 3 фильтрата, добавляют 0,5 см 3 ацетатного буфера, 0,5 см 3 спиртового раствора гваякола, 0,25 см 3 свежеприготовленного раствора пероксида водорода и встряхивают. При достаточной термической обработке мясного изделия раствор остается бесцветным, при недостаточной, в зависимости от количества сохраненной пероксидазы, окраска может быть от светло-голубой до темно-синей и проявляется в течение 1 мин.
При использовании спиртового раствора бензидина или спиртового раствора амидопирина в пробирку отбирают 1 см 3 фильтрата, добавляют 1 см 3 одного из указанных растворов, а также 0,5 см 3 раствора пероксида водорода и встряхивают. При наличии пероксидазы в течение 1 мин. появляется соответственно сине-зеленое или сине-фиолетовое окрашивание. При достаточной тепловой обработке изменения цвета не происходит.
Учитывая, что в мясе больных животных и в несвежем мясе происходит инактивация фермента пероксидазы, для окончательного суждения о качестве тепловой обработки кулинарных изделий необходимо проверить наличие пероксидазы в мясном полуфабрикате. При отсутствии пероксидазы в полуфабрикате достаточность тепловой обработки определяют пробой на фосфатазу.
Проба на фосфатазу
Качественная реакция. Метод основан на способности фермента фосфатазы расщеплять бариевую соль паранитрофенилфосфата при температуре 38 °C, освобождая паранитрофенол, который окрашивает среду в желтый цвет.
Весы лабораторные; плитка электрическая; баня водяная; ступка фарфоровая диаметром 7-9 см; цилиндр вместимостью 1 см 3 ; воронка делительная вместимостью 250 см 3 ; пробки корковые; капельница; воронки стеклянные диаметром 4-5 см; марля; бумага фильтровальная; вата стеклянная; бариевая соль паранитрофосфата, насыщенный раствор; гидроксид натрия, раствор массовой концентрации 400 г/дм 3 (Д = 1,43 г/куб. см); хлорид магния, раствор массовой концентрации 5 г/ дм 3 ; ацетатный буфер pH 5,4; вода дистиллированная.
Проведение испытания. Измельченную навеску, взятую из внутренней части изделия в количестве 20 г и взвешенную с точностью до 0,01 г, переносят в ступку и растирают, добавляя постепенно 50 см 3 дистиллированной воды. Полученную взвесь процеживают через двойной слой марли, а оставшуюся в марле навеску отжимают, затем вытяжку фильтруют через сухой складчатый фильтр и делят пополам. Одну часть (фильтрат 1) исследуют непосредственно, другую (фильтрат 2) переносят в коническую колбу, доводят до кипения и снова фильтруют - эта часть фильтрата является контрольной.
Для проверки активности фосфатазы в пробирку отмеривают 1 см 3 фильтрата 1, прибавляют 2 капли раствора хлорида магния массовой концентрации 5 г/дм 3 , 2 капли ацетатного буфера (pH 5,4) и 0,5 см 3 раствора бариевой соли паранитрофенилфосфата.
Для контроля во вторую пробирку отмеривают 1 см 3 фильтрата 2 и добавляют те же реактивы, что и в первую. Обе пробирки помещают на 1 ч в водяную баню или термостат при температуре 37-38 °C. Затем в обе пробирки добавляют по капле раствора гидроксида натра.
При достаточной тепловой обработке кулинарного изделия окраска в обеих пробирках не меняется. При недостаточной тепловой обработке раствор желтеет.
Определение остаточной активности кислой фосфатазы (количественное определение). Метод основан на фотометрическом определении в продукте интенсивности развивающейся окраски, зависящей от остаточной активности кислой фосфатазы, выраженной массовой долей фенола.
Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; потенциометр с погрешностью измерения ± 0,06 pH; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр для измерения в видимой области спектра; ультратермостат или водяная баня; воронки; колбы мерные вместимостью 500 и 1000 см 3 ; пипетки градуированные на 1; 5; 10 см 3 ; палочки стеклянные; пробирки; бумага фильтровальная; груша резиновая; кислота лимонная; цитрат натрия 5-водный; динатриевая соль фенилфосфорной кислоты, раствор массовой концентрации 2 г/дм 3 , свежеприготовленный; кислота трихлоруксусная, кристаллическая, растворы массовой концентрации 50 и 200 г/дм 3 ; гидроксид натрия, раствор C(NaOH) = 0,5 моль/дм 3 ; вода дистиллированная; фенол; толуол; вольфрамат натрия; сульфат лития 1-водный; кислота ортофосфорная плотностью 1,72 г/см 3 ; кислота соляная плотностью 1,19 г/см 3 ; бром.
Подготовка к испытанию. Ацетатный буфер : в мерной колбе вместимостью 1000 см 3 в дистиллированной воде растворяют 13,88 г цитрата натрия и 0,588 г лимонной кислоты, доливают водой до метки и перемешивают, pH буфера 6,5. Затем добавляют 1 см 3 толуола. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 ±1°C не более 12 сут.
Реактив Фолина: 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия растворяют в 700 см 3 дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 см 3 ортофосфорной кислоты и 100 см 3 соляной кислоты. Смесь осторожно кипятят в течение 10 ч в колбе вместимостью 2000 см 3 с обратным холодильником, после чего охлаждают и добавляют 150 г сульфата лития, 50 см 3 воды и несколько капель брома. Остаток брома отгоняют кипячением смеси без холодильника в вытяжном шкафу, охлаждают, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 , доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют. Реактив должен быть золотисто-желтого цвета без зеленого оттенка; его хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте не более 6 мес.
Стандартный раствор : 2 г фенола (взвешивают с точностью до 0,001 г) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1000 см 3 , доводят объем до метки и перемешивают. Отбирают пипеткой с помощью резиновой груши 5 см 3 раствора в колбу вместимостью 500 см 3 , добавляют около 300 см 3 дистиллированной воды, вносят 25 г кристаллической трихлоруксусной кислоты. После растворения содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Полученный раствор содержит 20 мкг фенола в 1 см 3 .
Построение градуировочного графика . В пробирки вносят следующие объемы стандартного раствора: 0; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 см 3 , что соответствует массе фенола: 0; 5; 10; 20; 30; 40 мкг. Доводят объем каждой пробирки до 2,5 см 3 , добавляя соответствующий объем раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/дм 3 (2,5; 2,25; 2,0; 1,5; 1,0; 0,5 см 3), и перемешивают. В каждую пробирку добавляют 5 см 3 раствора гидроксида натрия, перемешивают, выдерживают 10 мин., добавляют 1,5 см 3 реактива Фолина, разведенного дистиллированной водой в соотношении 1:2, и перемешивают.
Через 30 мин. измеряют оптическую плотность растворов по отношению к раствору трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/дм 3 на фотоэлектроколориметре с применением светофильтра с длиной волны 600 ± 10 нм в кювете с расстоянием между рабочими гранями 10 мм или спектрофотометра при длине волны 600 нм в кювете аналогичного размера.
По полученным средним данным по трем стандартным растворам на миллиметровой бумаге размером 20x20 см строят градуировочный график. На оси абсцисс откладывают значение массовой доли фенола (микрограмм в 9 см 3 окрашенного раствора); на оси ординат - значение соответствующей оптической плотности (Д). Градуировочный график должен проходить через начало координат.
Проведение испытания. От объединенной пробы, подготовленной к испытанию, берут 2 навески массой по 1 г (с точностью до 0,001 г) и переносят в две пробирки (контрольную и опытную).
В пробирки вносят по 10 см 3 ацетатного буфера pH 6,5, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и настаивают в течение 20 мин. при температуре 20 °C, периодически перемешивая.
В контрольную пробирку добавляют 5 см 3 (200 г/дм 3) раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и добавляют 5 см 3 (2 г/дм 3) раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты, выдерживают 10 мин и фильтруют.
В опытную пробирку добавляют 5 см 3 (2 г/дм 3) раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты и помещают в термостат при температуре 39 ± 1 °C на 1 ч, затем добавляют 5 см 3 200 г/дм 3 раствора трихлоруксусной кислоты, выдерживают 10 мин. и фильтруют.
Для проведения цветной реакции из контрольной и опытной пробирок отбирают по 2,5 см 3 безбелкового фильтрата. Цветную реакцию проводят по методу, описанному выше.
Массу фенола в навеске определяют по градуировочному графику.
Обработка результатов. Массовую долю фенола (X, %) вычисляют по формуле:
m 1 - масса фенола в опытной пробирке, найденная по
градуировочному графику, мкг;
m 2 - масса фенола в контрольной пробирке, найденная по
градуировочному графику, мкг;
m - масса анализируемой пробы, г;
10 - коэффициент пересчета;
20 - разведение;
2,5 - объем фильтрата, отобранный для цветной реакции,
Вычисление проводят до 0,0001.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допустимое расхождение между которыми при P = 0,95 не должно превышать 10% по отношению к среднему арифметическому.
Окончательный результат определяют до 0,001.
Анализ результатов работы: сделать выводы о влиянии сульфитации на активность окислительно-восстановительных процессов, сравнить активность каталазы в разных образцах.
1. Что такое ферменты?
2. Какими свойствами обладают ферменты?
3. Какие факторы влияют на активность ферментов?
4. Какой принцип положен в основу классификации ферментов? Сколько классов ферментов включает их классификация?
5. Какова роль окислительно-восстановительных ферментов?
6. Каковы строение и механизм действия дегидрогеназ?
7. Каковы строение и механизм действия полифенолоксидазы?
8. Каковы строение и механизм действия аскорбатоксидазы?
9. Каковы строение и механизм действия липоксигеназы?
10. Каковы строение и механизм действия пероксидазы?
11. Каковы строение и механизм действия каталазы?
12. Какова роль каталазы в пищевых технологиях и в процессах жизнедеятельности клетки?
13. Как определить активность каталазы?
Задания к теме
1. Каким свойством обладают ферменты?
а) Специфичность действия.
б) Способность сдвигать равновесие в системе.
в) Термостабильность.
г) Универсальность действия.
2. Какая из аминокислот наиболее часто входит в активный центр фермента?
а)Серин, б)Глицин, в)Валин, г)Метионин.
3. Для чего служит каталитический центр фермента?
а) Присоединение кофермента.
б) Превращение субстрата.
в) Связывание эффекторов.
4. Какой класс ферментов ускоряет реакции распада с участием воды?
а) Оксидоредуктазы, б) Трансферазы, в) Гидролазы, г) Лиазы.
5. Какие реакции ускоряют ферменты класса лигаз?
а) Негидролитический распад органических молекул.
в) Реакции синтеза.
6. Что такое кофермент?
б) Небелковое, легко отделяющееся от фермента вещество, участвующее в катализе.
в) Неактивный предшественник фермента.
г) Активатор фермента.
7. Для чего служит контактный участок?
а) Присоединение кофермента.
б) Превращение субстрата.
в) Связывание эффекторов.
г) Присоединение и ориентация субстрата.
8. Что такое изоэнзимы?
а) Ферменты, катализирующие реакции изомеризации.
б) Денатурированные энзимы.
в) Ферменты, имеющие разную четвертичную структуру, но катализирующие одну и ту же реакцию.
г) Энзимы, имеющие одинаковую брутто-формулу, но разное строение.
9. Какие реакции ускоряют ферменты класса лиаз?
а) Негидролитический распад и синтез с образованием двойных связей.
б) Реакции переноса функциональных групп.
в) Реакции изомеризации.
г) Окислительно-восстановительные реакции.
10. Что такое простетическая группа?
а) Фермент, связанный с субстратом.
б) Небелковая часть молекулы фермента, легко отделяющаяся от него.
в) Небелковая часть молекулы, прочно связанная с апоферментом.
г) Фрагмент одного из витаминов.
Проверь себя
1. Совокупность каталитического и субстратного центров фермента называется:
а) апофермент, б) активный центр фермента, в) аллостерически участок.
2. Небелковая часть сложного фермента, ответственная за катализ называется:
а) кофермент, б) кофактор, в) апофермет.
3. Клеточные ферменты, локализованные в цитоплазме, проявляют максимальную активность при рН, близком к:
а) 7, б) 2-3, в) 4-5, г) 9-10.
4. В состав кофермента входит витамин:
а) А, б) В 6 , в) В 2 , г) К.
5. Ферменты, катализирующие синтез биологических молекул с участием АТФ относятся к классу:
а) трансфераз, б) лигаз, в) гидролаз, г) лиаз, д) изомераз.
